Контрольная работа: Ферменты
Фермент. В отличие от рестриктирующих эндонуклеаз типов I и III ферменты типа II, подобные EcoRI, не катализируют метилирования. Метилазную активность проявляет другой белок. Активная эндонуклеаза EcoRI представляет собой димер, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей с мол. массой 31000. Исходя из гомодимерной структуры можно было бы ожидать, что фермент будет действовать симметрично на идентичные последовательности двух частей сайта узнавания и разрезать обе цепи одновременно. Однако на самом деле гидролиз происходит последовательно.
Белок взаимодействует с участком около десяти пар оснований; шесть из них находятся в пределах сайта узнавания, остальные являются фланкирующими. Именно эти фланкирующие последовательности, по-видимому, определяют выбор цепи, которая будет разрезана первой. Кроме того, фланкирующие пары оснований влияют на общую скорость разрезания в данном сайте узнавания, так что в разных сайтах одной молекулы ДНК гидролиз осуществляется с разной скоростью. Были получены кристаллы комплекса EcoRI и олигонуклеотида 5'-TCGCGAATTCGCG‑3' и проведен их рентгеноструктурный анализ. Это позволило в деталях выяснить способ взаимодействия данного фермента и ДНК. Было установлено, что между двумя остатками аргинина и одним глутаматом, с одной стороны, и парами оснований в сайте узнавания ‑ с другой, образуются водородные связи, в результате чего происходит частичное раскручивание В-ДНК. О свойствах других рестриктирующих эндонуклеаз типа II известно значительно меньше, но, по-видимому, они аналогичны свойствам EcoRI.
в. Различные группы рестриктирующих эндонуклеаз типа II
Большой каталог реактивов. У всех ферментов обнаружено около 90 разных сайтов узнавания. Каждый из ферментов получен из определенного прокариотического организма, что и отражено в его названии. Так, EcoRI ведет свое происхождение из штамма EscherichiacoliК12; HaeII и HaeIII – из Haemophilusaegyptius; BamHI– из Bacillusamyloliquefaciensштамма H; MboI и MboII– из Moraxellabovisи т.д. Два разных фермента, имеющие одинаковые сайты узнавания, называются изошизомерами. Однако изошизомеры не обязательно делают разрез в одном и том же месте; сравните, например, XmaI и SmaI.
Палиндромные сайты узнавания и разрезания. Эндонуклеаза EcoRI– одна из многих рестриктирующих эндонуклеаз типа II, которые узнают различные палиндромные нуклеотидные последовательности и делают разрезы, в результате чего образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными хвостами. В пределах этой группы можно выделить несколько разновидностей ферментов. Например, EcoRI, HindIII и некоторые другие эндонуклеазы узнают последовательности из шести пар оснований; эндонуклеаза HinfI узнает пять пар оснований, из которых центральным остатком может быть любой из четырех нуклеотидов. Эднонуклеаза BglI узнает шесть специфических нуклеотидных остатков, но они должны быть разделены в середине любыми другими пятью парами оснований. Эндонуклеаза NotI имеет сайт узнавания протяженностью восемь пар оснований; такие ферменты, как TaqI и MboI, имеют сайты узнавания из четырех нуклеотидов. Другая известная особенность касается свойств одноцепочечных концов, образующихся при действии различных рестриктирующих эндонук-леаз. Эндонуклеазы EcoRI, HindIII, MboI и Оа I образуют одноцепочечные хвосты, состоящие из 5'-концевых остатков каждой цепи, а эндонуклеазы PstI и HaeII – из 3'-остатков.
Эндонуклеазы, имеющие различные сайты узнавания и разрезания, часто образуют идентичные липкие концы. Например, под действием эндонуклеаз MboI, BclI и BamHI образуются 5'-концевые 5'-GATC‑3'. В результате фрагменты, получающиеся при расщеплении данной ДНК любым из этих ферментов, при смешивании и отжиге будут соединяться друг с другом. Однако фрагменты, получающиеся из различных ДНК при разрезании эндонуклеазой BglI, вряд ли будут соединяться при отжиге, поскольку одноцепочечные хвосты могут содержать любую последовательность из трех нуклеотидов.
Другие рестриктирующие эндонуклеазы типа IIтакже узнают специфические палиндромные нуклеотидные последовательности, но разрезают фосфодиэфирный мостик в середине узнаваемой последовательности, в результате чего образуются фрагменты ДНК с тупымидвухцепочечными концами.
Непалиндромные сайты узнавания с разрезанием на некотором расстоянии от них. Ферменты типа II, но другой разновидности тоже узнают специфические нуклеотидные последовательности, но гидролизуют фосфодиэфирные мостики вне этих последовательностей. При этом узнаваемая последовательность не является палиндромом. В этих случаях рестриктирующие эндонуклеазы, по-видимому, «отсчитывают» точное число пар оснований от узнаваемой последовательности и затем разрезают цепи. Механизм отсчета таков, что места гидролиза разных цепей смещены одно относительно другого на один нуклеотид. В результате образуются фрагменты ДНК с одноцепочечными выступами длиной только в один нуклеотидный остаток.
г. Картирование сегментов ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз типа II
С помощью рестриктирующих эндонуклеаз можно разрезать сложные геномы или длинные сегменты ДНК на воспроизводимые наборы более мелких единиц. В свою очередь такие единицы можно разделить по размерам с помощью нескольких методов. Чаще всего для этого используют электрофорез фрагментов ДНК в полужидком геле, приготовленном на основе агарозы или полиакриламида. Обычно подвижность двухцепочечного фрагмента в электрическом поле обратно пропорциональна логарифму его размера. Используя в качестве маркеров фрагменты известной длины, легко определить размер интересующего нас фрагмента с помощью линейки и простого графика. Для проведения такого анализа обычно достаточно менее 1 мкг ДНК, поскольку фрагменты легко выявляются при окрашивании соответствующим красителем, например бромистым этидием.
Набор фрагментов, получающихся при расщеплении ДНК определенной рестриктирующей эндонуклеазой, является своеобразным «отпечатком пальцев» этой ДНК. Определяя, какие фрагменты образуются при расщеплении ДНК несколькими рестриктазами по отдельности и в разных комбинациях, часто удается установить порядок расположения сегментов в исходной молекуле, т.е. построить физическую карту ДНК, где указано положение каждого сегмента. Сложные геномы или большие молекулы ДНК дают при обработке рестриктирующими эндонуклеазами сложные наборы фрагментов, и для их анализа используют специальные компьютерные программы.
д. Защита ДНК посредством метилирования
Родственные метилазы. Геномы бактерий, кодирующие рестриктирующие эндонуклеазы, защищены от самодеградации с помощью специфических систем модификации. Метилазы, осуществляющие специфическую модификацию, узнают те же нуклеорестрикции в ДНК проявляют устойчивость к действию определенных эндонуклеаз. Например, в ДНК позвоночных часто встречаются динуклеотиды 5'-meCG‑3'. Если сайт рестрикции эндонуклеазы HpaII содержит такой метилированный динуклеотид, то фермент не может разрезать ДНК в этом месте. Этот факт используется для определения в сложных геномах состояния метилирования таких динуклеотидов 5'-CG‑3', которые находятся в сайтах узнавания HpaII. Несмотря на неспособность эндонуклеазы HpaII разрезать динуклеотид 5'-CmeCGG‑3', ее изошизомер, эндонуклеаза MspI, осуществляет такое разрезание. Сравнивая чувствительность фрагментов ДНК к двум указанным ферментам, можно локализовать метилированный цитозин на карте. Подобным же образом часто встречающуюся в ДНК растений последовательность 5'-СmеСT A GG‑3' можно отличить от неметилированной формы, 5'-СС‑3', если сравнить продукты, получающиеся при расщеплении ДНК с помощью изо-шизомеров BstNI и EcoRII.
Независимые метилазы E. coli. При включении фрагментов эукариотической ДНК в бактериальные векторы и их репликации в клетках Е. coliили других прокариот характерный для них тип метилирования утрачивается и они метилируются способом, специфичным для новой клетки-хозяина. Например, в клетках Е. coliдинуклеотиды 5'-CG‑3' не метилируются, и в результате сайты, ранее защищенные от действия эндонуклеазы HpaII, становятся чувствительными к ней. Однако два обычных фермента E. coli: damДНК-метилтрансфераза, которая метилирует остаток А в последовательности 5'-GATC‑3', и dcmДНК-метилтрансфераза, метилирующая остаток С в последовательности 5'-СС‑3', – образуют новые устойчивые сайты; ни одна из этих метилаз не является частью системы рестрикции-модификации. Кроме того, эукариотическая ДНК, реплицированная в E. coli, становится устойчивой к эндонуклеазам MboI и BclI благодаря тому, что в пределах их сайтов узнавания находится 6‑метиладенин. Заметим, что тот же самый 6‑метиладенин в сайте 5'-GATC‑3' не мешает работе эндонуклеаз BamHI, BglI или Sau3А; однако разрезание с помощью Sau3А блокируется, если метилирован остаток С.
Фосфомоноэстеразы
Часто при проведении экспериментов с рекомбинантными ДНК или при анализе структуры ДНК приходится отщеплять концевые фосфомоноэфирные группы. Известно множество неспецифических фосфомоноэстераз. Эти ферменты, выделенные из клеток Е. coliи кишечника теленка, были получены в высокоочищенном виде. Фосфатазы гидролизуют как 5'-, так и 3'-концевые фосфомоноэфиры в ДНК и РНК.
Фосфомоноэфирные группы, находящиеся на конце одноцепочечных разрывов в дуплексной ДНК или экранированные нависающей над ними второй цепью, подобные тем, которые образуются при разрезании эндонуклеазой PstI, удаляются с помощью фосфатазы только при слабоденатурирующих условиях.
Полинуклеотидкиназа
Киназы составляют большой класс ферментов, катализирующих фосфорилирование многих биохимических соединений – от небольших молекул до очень крупных макромолекул, включая полипептиды и полинуклеотиды.
Полинуклеотидкиназа, широко используемая в качестве реактива в экспериментах с рекомбинантными ДНК, была выделена и очищена из клеток E. coli, инфицированных бактериофагом Т4. Фермент кодируется геномом бактериофага. Донором фосфата служит АТР, а одним из продуктов реакции является ADP. В ходе реакции специфически фосфорилируются 5'-концевые гидроксильные группы молекул ДНК и РНК; 3'-концевые гидроксильные группы не фосфорилируются. Одной из важных сфер применения полинуклеотидкиназы является мечение 5'-конца полинуклеотидной цепи с помощью радиоактивного 32 Р с использованием АТР, меченной по у-фосфату. Последовательное действие фосфатазы и полинуклеотидкиназы приводит к замещению немеченого 5'-концевого фосфомоноэфира на радиоактивный без каких-либо других изменений в цепи.
ДНК-лигаза
Получение рекомбинантных молекул ДНК включает объединение invitro сегментов ДНК из различных источников. Благодаря тому, что при расщеплении ДНК определенными эндонуклеазами образуются фрагменты с липкими концами, при отжиге эти фрагменты довольно легко соединяются, однако водородные связи, удерживающие их вместе, в обычных условиях оказываются относительно слабыми и легко разрушаются. Для ковалентного сшивания фрагментов используют ДНК-лигазу, которая катализирует образование фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами.
Чтобы лигирование было успешным, в объединяемых цепях должен произойти отжиг комплементарных концов; в этом случае происходит лигирование обеих цепей. Если два одноцепочечных сегмента удерживаются рядом за счет образования водородных связей с интактной комплементарной цепью, то образование фосфодиэфирной связи происходит только в одной цепи. ДНК-лигаза фага Т4 способна также соединить двухцепочечные молекулы с тупыми концами, катализируя образование фосфо-диэфирных связей в обеих цепях.
Цепи удлиняются путем последовательного присоединения нуклеотидов к праймеру со свободной 3'-гид-роксильной группой; выбор нуклеотидного остатка на каждом этапе определяется ДНК-матрицей. ДНК-полимераза IE. coliкатализирует и некоторые другие важные реакции. Две из них имеют особое значение для экспериментов с рекомбинантными ДНК: это 3'–>5'- и 5'–>3'-экзонуклеазные реакции. В обоих случаях образуются продукты с 5'-фосфомоноэфирными концами. Две указанные экзонуклеазные активности присущи разным участкам молекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разделить, обработав белок протеолитическими ферментами. После разделения обнаруживается, что 3'–>5'-экзонуклеазная и полимеразная активности связаны с большим по размеру полипептидом, содержащим карбоксильную группу на конце, а 5'–>3'-экзонуклеазная активность – со вторым, более мелким фрагментом.
б. Никтрансляция
Реакции, катализируемые ДНК-полимеразой I, нашли широкое применение. Например, часто используется способность ДНК-полимеразы I катализировать одновременно как полимеризацию, так и 5'–>3'-экзонуклеазное расщепление. Фермент, выступая в роли экзонуклеазы, осуществляет деградацию цепи в 5'–>3'-направлении, начиная с 5'-конца одноцепочечной бреши в двухцепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы, восстанавливает цепь путем последовательного присоединения мононуклеотидных остатков к свободной 3'-гидроксильной группе на другом конце бреши. Собственно синтеза ДНК не происходит: брешь лишь перемещается вдоль цепи, чем и объясняется название этого процесса – никтрансляция.Проводя никтрансляцию в присутствии а-32 Р-меченных дезоксинуклеозидтрифосфатов, в качестве субстратов получают меченые фрагменты ДНК с высокой удельной активностью.
в. Заполнение брешей
ДНК-полимераза способна превращать фрагменты ДНК с липкими концами во фрагменты с тупыми концами при наличии выступающего 5'-конца. 3'-гидроксильный конец служит праймером, 5'-выступ – матрицей; пробел на 3'-конце заполняется путем последовательного присоединения дезоксинуклеотидных остатков. Для заполнения лучше использовать большой карбоксиконцевой фрагмент ДНК-полимеразы I, получаемый в результате протеолиза; это позволяет избежать 5'–>3'-экзонуклеазного расщепления матрицы. Липкие концы можно превратить в тупые и с помощью специфичной к одноцепочечной ДНК нуклеазы, однако в этом случае утрачивается несколько нуклеотидных остатков.
РНК-зависимые ДНК-полимеразы