Контрольная работа: Основы теории и основные понятия процесса хроматографического разделения
Разрешение, таким образом, определяется произведением трехсомножителей, первый из которых выражает зависимость от селективности колонки, второй — от коэффициента емкости колонки и третий — от эффективности колонки (ЧТТ).
Рассмотрим это важнейшее уравнение более подробно. Если, α=1, то разрешение равно 0, т.е. разделения нет независима от числа теоретических тарелок в колонке. Однако из характера функции α в уравнении видно, что небольшие изменения могут привести к заметному увеличению разрешения, особенно для тех случаев, когда значения α близки к 1. Если за счет подбора условий разделения удается изменить α с 1,1 до 1,2, это приводит к улучшению разрешения в два раза. Таким образом, на фактор селективности следует обращать основное внимание при подборе условий разделения, учитывая различие во взаимодействии разделяемых компонентов как в неподвижной, так и в подвижной фазе. В отличие от газовой хроматографии, в которой взаимодействия в подвижной (газовой) фазе незначительны и селективность системы в основном определяется только взаимодействиями веществ с неподвижной фазой, в жидкостной хроматографии подвижная (жидкая) фаза не является инертной, а может играть главную роль в процессе термодинамического распределения между неподвижной и подвижной фазами вследствие селективного взаимодействия разделяемых веществ с подвижной фазой. Поэтому в выборе условий для высокоселективного разделения как выбор сорбента, так и выбор растворителя играют одинаково важную роль, а искусство хроматографиста в ВЭЖХ более многогранно и требует учета большего числа взаимодействий между молекулами, чем в ГХ.
Второй сомножитель в уравнении принимает значение, равное 0 (при этом разрешение также равно 0, т.е. разделение отсутствует) в том случае, когда коэффициент емкости для второго компонента равен 0, т.е. оба разделяемых компонента элюируются как несорбируемые вещества (взаимодействие с неподвижной фазой отсутствует). С ростом значения k' разрешение увеличивается, при этом скорость анализа падает.
Наконец, из третьего сомножителя видно, что достигаемое разрешение пропорционально корню квадратному из числа теоретических тарелок, т.е. для увеличения разрешения вдвое нужно увеличить эффективность колонки в 4 раза (например, использовать колонку в 4 раза длиннее). Удлинение колонки в 4 раза приводит к увеличению продолжительности анализа также вчетверо, т. е. скорость анализа падает. Как правило, если эффективность колонки недостаточна, а скорость анализа является важным фактором, идут по другому пути для повышения эффективности — используют колонку с более мелким по зернению сорбентом. Однако в этом случае платой за большую эффективность при той же скорости анализа является повышение давления на колонке.
Следует отметить, что, хотя из уравнения и очевидно, что эффективность колонки меньше влияет на разрешение, чем ее селективность и коэффициент емкости, так как разрешение пропорционально корню квадратному из эффективности, тем не менее повышению эффективности колонок придается большое значение и уделяется огромное внимание как производителями колонок, так и их потребителями. Это связано с тем, что для сложных многокомпонентных смесей, особенно смесей неизвестного состава, часто не удается подобрать условия так, чтобы селективность была высокой для всех компонентов. В этом случае высокая эффективность колонки позволяет добиться разделения для пар веществ с небольшим значением α.
1.2 РАЗМЫВАНИЕ В КОЛОНКЕ И ВНЕ ЕЕ
Вещества вводятся в колонку в виде узкой зоны, которая по мере ее движения с подвижной фазой по колонке становится все шире, т. е. размывается в результате диффузионных процессов. Мерой этого размывания в колонке является высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ). Установлено, что размывание полосы в хроматографической колонке обусловлено тремя причинами: наличием вихревой диффузии, молекулярной диффузии и сопротивления массопередаче. Общая ВЭТТ (H ) колонки получается путем суммирования вкладов всех этих факторов, вызывающих размывание хроматографической зоны:
H = Hp + Hd + Hs + Hm ,
где Нр — вклад в размывание вихревой диффузии; На — вклад в размывание молекулярной диффузии; Hs — вклад, связанный с сопротивлением массопередаче в неподвижной фазе; Нт — вклад, связанный с сопротивлением массопередаче в подвижной фазе.
Не вдаваясь в подробное рассмотрение этих вкладов в ВЭТТ, тем не менее следует заметить, что чем меньше каждое из четырех слагаемых, тем меньше будет и суммарное значение ВЭТТ и, следовательно, эффективнее колонка. Величина Нр пропорциональна диаметру частиц сорбента и уменьшается с улучшением равномерности заполнения
Рис. 1.4. Зависимость ВЭТТ от скорости подачи растворителя (V, мл/мин).
Вклад в размывание пика разных факторовколонки сорбентом. Величина Hd растет при использовании очень малых скоростей потока, при обычно используемых высоких скоростях Hd настолько мала, что ею можно пренебречь. Величина Нm уменьшается при ускорении процессов адсорбции — десорбции в неподвижной фазе, т. е. при использовании частиц малого размера и тонких пленок неподвижной фазы, при уменьшении скорости потока. Величина Нm уменьшается при уменьшении размера частиц (пропорционально квадрату диаметра частиц), более равномерном и плотном заполнении колонки сорбентом, менее вязком растворителе, меньших скоростях потока.
Если изобразить графически зависимость ВЭТТ от скорости подачи растворителя, то она будет иметь вид, изображенный на рис.1.4. На нем можно видеть и оценить вклад каждой из составляющих в значение ВЭТТ.
Таким образом, размывание в колонке уменьшается и эффективность повышается, когда используют более мелкий сорбент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использовании более тонких слоев привитой фазы, менее вязких растворителей и оптимальных скоростей потока.
Однако наряду с размыванием полосы хроматографической зоны в процессе разделения в колонке может происходить также и размывание ее в устройстве для ввода пробы, в соединительных капиллярах инжектор — колонка и колонка — детектор, в ячейке детектора и в некоторых вспомогательных устройствах (микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, пред-колонки, реакторы-змеевики и др.). Размывание при этом тем больше, чем больше внеколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. Имеет также значение и то, в каком месте находится мертвый объем: чем уже хроматографическая зона, тем большее размывание даст мертвый объем. Поэтому особое внимание следует уделять конструированию той части хроматографа, где хроматографическая зона наиболее узкая (инжектор и устройства от инжектора до колонки) — здесь внеколоночное размывание наиболее опасно и сказывается наиболее сильно. Хотя считается, что в хорошо сконструированных хроматографах источники дополнительного внеколоночного размывания должны быть сведены до минимума, тем не менее каждый новый прибор, каждая переделка хроматографа должны обязательно заканчиваться тестированием на колонке и сравнением полученной хроматограммы с паспортной. Если наблюдается искажение пика, резкое снижение эффективности, следует тщательно проинспектировать вновь введенные в систему капилляры и другие устройства.Размывание вне колонки и его неправильная оценка могут привести к значительной (более 50%) потере эффективности, особенно в тех случаях, когда относительно давно сконструированные хроматографы пытаются использовать для высокоскоростной ВЭЖХ, микроколоночной ВЭЖХ и других вариантов современной ВЭЖХ, требующих микроинжекторов, соединительных капилляров с внутренним диаметром 0,05-0,15 мм минимальной длины, колонок вместимостью 10-1000 мкл, детекторов с микрокюветами емкостью 0,03-1 мкл и с высоким быстродействием, высокоскоростных самописцев и интеграторов.
1.3 УДЕРЖИВАНИЕ И СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ
Для того чтобы анализируемые вещества разделялись на колонке, как уже упоминалось выше, коэффициент емкости k' должен быть больше 0, т.е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости не должен быть и слишком большим, чтобы получить приемлемое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбрана неподвижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики анализа заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном случае различные для всех компонентов, но приемлемо не очень большие k'. Этого добиваются, меняя элюирующую силу растворителя.
В случае адсорбционной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного растворителя (например, гексана с добавкой изопропанола) увеличивают, увеличивая в нем содержание полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, уменьшая содержание изопропанола. Если содержание полярного компонента становится слишком малым (менее 0,1%), следует заменить его более слабым по элюирующей силе. Так же поступают, заменяя на другие либо полярную, либо неполярную составляющую и в том случае, если данная система не обеспечивает желаемой селективности по отношению к интересующим компонентам смеси. При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимости компонентов смеси, так и элюотропные ряды растворителей, составленные разными авторами.
Примерно так же подбирают силу растворителя в случае использования привитых полярных фаз (нитрил, амино, диол, нитро и др.), учитывая возможные химические реакции и исключая опасные для фазы растворители (например, альдегиды и кетоны для аминофазы).
В случае обращенно-фазной хроматографии силу растворителя увеличивают, повышая содержание в элюенте органической составляющей (метанола, ацетонитрила или ТГФ) и уменьшают, добавляя больше воды. Если не удается добиться желаемой селективности, используют другую органическую составляющую либо пытаются изменить ее с помощью разных добавок (кислот, ион-парных реагентов и др.).
При разделениях методом ионообменной хроматографии силу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентрацию буферного раствора или меняя рН, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами.
Однако, особенно в случае сложных природных и биологических смесей, зачастую не удается подобрать силу растворителя таким образом, чтобы все компоненты пробы элюировались за приемлемый срок. Тогда приходится прибегать к градиентному элюированию, т.е. использовать растворитель, элюирующая сила которого в процессе анализа изменяется так, что она постоянно увеличивается по заранее заданной программе. Таким приемом удается добиться элюирования всех компонентов сложных смесей за относительно короткий промежуток времени и их разделения на компоненты в виде узких пиков.
1.4 РАЗМЕР ЧАСТИЦ СОРБЕНТА, ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Рассматривая размывание в колонке, мы указывали, что эффективность колонки (ВЭТТ) зависит от размера частиц сорбента. В большой степени бурное развитие ВЭЖХ за передние 10-12 лет было обусловлено, во-первых, разработкой способов получения сорбентов с размером частиц от 3 до 10 мкм и с узким фракционным составом, обеспечивающих высокую эффективность при хорошей проницаемости, во-вторых, разработкой способов заполнения этими сорбентами колонок и, в-третьих, разработкой и серийным выпуском жидкостных хроматографов, имеющих рассчитанные на высокие давления насосы, инжекторы и детекторы с кюветами малого объема, способные регистрировать пики малого объема.
Для хорошо упакованных суспензионным способом колонок приведен-ная высота, эквивалентная теоретической тарелке (ПВЭТТ), может составлять 2 независимо от того, использовали ли для упаковки частицы с размером 3, 5, 10 или 20 мкм. В этом случае мы получим соответственно колонки (при стандартной длине их 250 мм) эффективностью 41670, 25000, 12500 и 6250 т.т. Кажется естественным выбрать наиболее эффективную колонку, заполненную частицами размером 3 мкм. Однако за эту эффективность придется заплатить использованием при работе очень высокого давления и относительно невысокой скоростью разделения, так как имеющийся насос, скорее всего, будет неспособен прокачивать через такую колонку растворитель с высокой объемной скоростью. Здесь мы как раз и сталкиваемся с вопросом о связи размера частиц сорбента, эффективности и проницаемости колонок.
Уравнение, которое связывает давление, размер частиц и другие важные хроматографические параметры, имеет следующий вид:
u = K 0 p / ηL = pdc 2 / ϕ ηL
где u — линейная скорость потока, определяемая из уравнения to = L / u ; К0 — проницаемость колонки ; р — давление; η — вязкость; L — длина колонки ; ϕ — фактор сопротивления колонки.