Інкубація часток ХВК із транспортним білком ТБ1 переводить РНК у складі виріонів з нетрансльованої іn vіtro форми в трансльовану. Результати імуноелектронної мікроскопії преінкубованих препаратів ХВК-ТБ1 свідчать про те, що транспортний білок вибірково зв'язується з одним з кінців вірусної частки (приблизно відповідним 5′-кінцеві вірусної РНК). Можна припустити, що взаємодія з ТБ1 дестабілізує кінець вірусної частки.

Також були отримані результати, що вказують на існування другого способу трансляційної активації віріонної РНК ХВК. Показано, що фосфорилювання білка оболонки ХВК також створює доступну для рибосом іn vіtro РНК у складі вірусних часток.

Приведені вище дані дозволяють припустити існування двох різних механізмів переходу РНК у складі вірусних часток ХВК у трансльовану форму: перший - фосфорилювання БО вихідних віріонів, що попадають у первинно інфіковані клітини, і другий - взаємодія новосинтезованих вірусних часток, призначених для транспорту через плазмодесми, із транспортним білком ТБ1.

2.2 Способи передачі вірусу

У порівнянні з передачею вірусів у польових умовах за допомогою безхребетних або в результаті вегетативного розмноження передача механічним шляхом звичайно відіграє меншу роль. Однак для деяких вірусів цей спосіб передачі має велике практичне значення. Так, віруси можуть поширюватися на плантаціях, легко забруднюючи інструменти, руки й одяг працюючих там людей. Цей спосіб передачі вірусу має особливо велике практичне значення на ранніх етапах росту польових культур, зокрема при висаджуванні рослин. Рослини, інфіковані в ранній період росту, є джерелом поширення вірусу надалі, що відбувається або під час проведення необхідних для даної культури заходів, наприклад видалення бруньок, або в результаті зіткнення хворих і здорових рослин при вітрі. Х-вирус картоплі також легко може передаватися, забруднюючи знаряддя виробництва й обробні машини; передача здійснюється робітниками або тваринами, що раніше контактували з хворими рослинами, причому в деяких випадках вірус може зберігатися в такий спосіб протягом декількох тижнів.

Х-вірус картоплі може передаватися на здорові рослини як у результаті безпосереднього контакту між листками сусідніх рослин, так і в тому випадку, якщо листки таких рослин не контактують один з одним. Припускають, що передача в цьому випадку здійснюється в результаті контакту між коренями сусідніх рослин, однак не можна виключити і можливості того, що визначену роль при цьому грають деякі переносники, що живуть у ґрунті.

Існує ще багато хвороб, що, як уже відомо або як припускають, викликаються якимсь вірусом, однак самі вірусні частки не виділені і не ідентифіковані як инфицирующего агента. У цих випадках, щоб установити вірусну природу якогось визначеного захворювання за допомогою непрямих методів, необхідно насамперед передати захворювання на здорові рослини (часто це приходиться робити за допомогою щеплення, якщо всі інші способи виявляються безуспішними) і потім показати, що це захворювання по викликане клітинними паразитами або іншими агентами невірусної природи. Деякі умови, що можуть стимулювати вірусну інфекцію. Оскільки токсини також можуть передаватися шляхом щеплення, цю операцію, особливо на першому пасажі інфекційного матеріалу, необхідно здійснювати при повній відсутності клітинних паразитів або комах, що повиннео забезпечити елімінацію токсинів як можливої причини захворювання. Так, вірус великих жилок салату-латуку передавався при шести послідовно проведених щепленнях, і при цьому ступінь виразності симптомів не знижувалася. Цей факт виключає можливість того, що симптоми цього захворювання, викликані токсином, продуцируемым.

Міжклітинний транспорт вірусів рослин здійснюється за допомогою одного або декількох вірусспецифічних транспортних білків (ТБ). Саме транспортні білки відіграють ключову роль у переносі вірусного генома усередині інфікованої клітини до плазмодесм, далі в поширенні вірусної інфекції через плазмодесми по клітинах паренхіми і, у випадку деяких вірусів, у транспорті вірусного генома по судинах флоеми. Очевидно, що прогрес у дослідженні вірусних ТБ, їх взаємодій з вірусними нуклеїновими кислотами і різними вірусними і клітинними білками відкриває широкі перспективи для створення нових методів боротьби з вірусними інфекціями рослин.

Розділ 3. Використання Х-вірусу в сучасних дослідженнях

3.1 Метод отримання препаратів Х-вірусу картоплі для виробництва діагностичної сироватки

Х-вірус картоплі (ХВК) є одним з розповсюджених патогенів картоплі в усіх зонах вирощування культури. На Поліссі України спричинювані ним втрати врожаю становлять в середньому 40,8 % [1]. ХВК превалює у посівах в моноінфекції чи в комплексі з іншими мозаїчними вірусами (64 % обстежених зразків) при ступені ураженості сортозразка 5-100% [2]. Контроль насіннєвого матеріалу показує, що у відкритий грунт висаджується здоровий пробірковий матеріал, який у процесі подальшого розмноження зазнає реінфекції: ураженість клонового матеріалу становить 13-57 % залежно від імунологічних характеристик сорту, досягаючи 100 % на окремих сортах.

При аналізі відібраного в полі матеріалу виявляється латентна інфекція в 20-70 % зразків, що вказує на необхідність використання імунологічних методів діагностики вірусу для отримання об'єктивної інформації щодо якості матеріалу в насінницькій, селекційній роботі, ефективності захисних заходів, при вивченні циркуляції вірусу в природних умовах. Біологічні особливості ХВК дають можливість виявляти його у вегетуючих рослинах методом крапельної аглютинації [3] при чутливості методу 1-100 мкг/мл, а також методом імуноферментного аналізу.

Контроль фітопатогенних вірусів потребує методичного забезпечення. Пошук нових методичних підходів при розробці і виробництві засобів діагностики з урахуванням особливостей патогенів спрямований на створення ефективних діагностикумів фітопатогенних вірусів.У представленій роботі ми ставили за мету розробити метод отримання чистих препаратів ХВК для виробництва діагностичної антисироватки.

ХВК накопичували на рослинах томатів сорту Перемога, які вирощували в умовах вегетаційної камери при 20 °С і фотоперіоді 16 годин. Заражали рослини в фазі 3-4 справжніх листків методом механічної інокуляції з попереднім опудрюванням карборундом. Строк максимальної концентрації вірусу в рослинах томату — 21-25 днів після інокуляції.

При розробці методу очищення використовували відомі методики [5-8] та прилад для препаративного електрофорезу [9,10], сконструйований в нашому інституті.

Контроль етапів отримання чистих препаратів проводили з використанням реакції крапельної аглютинації [3] та електронної мікроскопії нативних препаратів, контрастованих 2%-ним розчином фосфорно-вольфрамової кислоти, рН 6,0. Досліджували препарати за допомогою елек-троного мікроскопа Tesla-540 при інструментальному збільшенні 22-30 тис.

Спектри поглинання УФ-світла препаратами МВК реєстрували на однопроменевому спектрофотометрі СФ-46.

Для виділення препарату ХВК листя томатів відбирали на 21-25-й день після зараження.

Проводили інфільтрацію в 0,3 М трис-гліциновому буферному розчині, рН 8,3 з додаванням 0,1 %-ного 2-меркаптоетанолу (ME) та 0,01 М ЕДТА протягом 12 годин за температури +4 °С.

Попередня інфільтрація рослинного матеріалу сприяла підвищенню ефективності екстракції вірусу, блокуючи дію ферментів рослинного соку.

Після інфільтрації листя подрібнювали на вальцевому пресі ПВЛ-1 в присутності 0,3 М трис-гліцинового буфера, рН 8,3 у співвідношенні 1:2. Отриманий гомогенат віджимали через капронове сито. Екстракт в трис-гліциновому буферному розчині містив менше пігменту, ніж при використанні фосфатного чи цитратного буферних розчинів, що значно поліпшувало наступні етапи очистки.

Освітлювали екстракт шляхом центрифугування за 15 000 об/хв протягом 20 хв. До надосадової рідини додавали краплями 20 %-ний розчин тритон Х-100 до кінцевої концентрації 0,5% та інкубували 30 хв., не застосовуючи на цьому етапі органічних розчинників, які різко знижують вихід вірусу [11, 12]. Додавання тритон-Х 100 зумовлює розчинення клітинних мембран і хлоропластів перед осадженням поліетиленгликолем (ТТЕГ).

Первинне концентрування вірусу проводили шляхом додавання до екстракту 20 %-ного розчину поліетиленгліколю (м.в. 40000) та NaCl до кінцевої концентрації 8 % та 1,5 %, відповідно. Витримували 1 годину при температурі +4 °С. Преципітат відділяли центрифугуванням за 6000 об/хв протягом 20 хв.

Після центрифугування при 6000 об/хв в надосадковій рідині вірус серологічно не виявлявся. Для повної екстракції вірусу необхідно було проводити декілька послідовних ресуспендувань осаду 0,01 М трис-гліциновим буфером, рН 8,3, кожен раз освітлюючи екстракт низькошвидкісним центрифугуванням. На цьому етапі загальний об'єм отриманого препарату вірусу не перевищував 1/10 від початкового об'єму рослинного екстракту.

Після осадження ПЕГ екстракція ХВК із преципітата, який містить значну кількість білків рослини-хазяїна, ускладнена. Це потребує застосування ряду циклів екстракції вірусу із осадів та контролю на кожному етапі для уникнення значної втрати вірусу. Екстракція МВК з осадів проходить більш ефективно, якщо для гомогенізації рослинної тканини використовувати трис-гліциновий буфер, а не фосфатний чи цитратний. При використанні трис-гліцинового буфера основна кількість вірусу екстрагується при перших двох етапах ресуспендування.

Остаточне очищення препарату ХВК здійснювали за допомогою приладу для препаративного електрофорезу із застосуванням 40%-ної сахарозної подушки.

При проведені препаративного електрофорезу ХВК необхідно було підібрати оптимальні умови для очищення вірусу: рН та іонну силу буферних розчинів, температурний режим, напругу електричного поля, тривалість, концентрацію сахарозної подушки, кількість антигену; який можна розділити [12].

Сконцентрований осадженням ПЕГ препарат вірусу нашаровували на 40%-у сахарозну подушку висотою 10 см та діаметром 1,5 см, яка була сформована в електрофоретичній колонці.

Електрофорез вели в лужній системі буферів за температури 16-20 °С, сили струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в протягом 3 годин.

При відпрацюванні цього етапу отримання препарату МВК виявили, що електрофорез в 40 % сахарозі є ефективним прийомом дляконцентрування ХВК та очищення його від рослинних компонентів.

В роботі ми використовували 0.01М трис-гліциновий буфер, рН 8,3, який найбільше підходить як для екстракції ХВК, так і для електрофорезу. Виходили з того, що буферний розчин, який використовується при електрофорезі, повинен мати низьку іонну силу (0,005-0,02), що дозволяє застосовувати високі градієнти напруги вздовж колонки при мінімальному утворенні тепла. Крім того, мають бути підібрані такі значення рН буферних розчинів, щоб різниця в зарядах між компонентами суміші, яка розділяється, була максимальною [7, 12].

Напругу поля належить підтримувати настільки високою, наскільки можливо за умов мінімального утворення та розсіювання тепла. При розробці нашого методу мінімальний нагрів і конвекцію спостерігали при силі струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в.