Выявить среды для выделения и идентификации микобактерий.

Охарактеризовать внутривидовую и межвидовую идентификацию микобактерий.

Рассмотреть медицинское и ветеринарное значение микроорганизмов, принадлежащих к роду Mycobacterium.

Изучить распространение микобактерий.

Осветить применение микобактерий в практике.

1. История изучения рода Mycobacterium

История изучения микобактерий началась в конце XIX века. В 1874 г.А. Хансен открыл палочку лепры - Mycobacterium leprae , а Р. Кох в 1882 г. - туберкулезную палочку - Mycobacterium tuberculosis . Эти два представителя одного рода известны как возбудители древнейших болезней человека: лепры и туберкулеза. В 1896 г. К.В. Lehmann и R. Neumann предложили ввести в систематику бактерий новый род Mycobacterium с включенными в него видами М . tuberculosis и М . leprae . Вскоре стали появляться сообщения об открытии других представителей этого рода - сапрофитных бактерий, широко распространенных в природе. В настоящее время род Mycobacterium включает свыше 90 видов. Согласно определителю Берджи, группа микобактерий содержит единственный род Mycobacterium [1].

2. Особенности морфологии микроорганизмов рода Mycobacterium

Все микобактерии неподвижны, окрашиваются по Граму положительно. На ранней стадии развития (впервые сутки) микобактерий имеют палочковидное строение клеток, и в этот момент они морфологически похожи на проактиномицетов, находящихся во второй стадии развития. Палочковидные клетки микобактерий, в отличие от бактериальных, имеют неправильные очертания: контуры их искривлены, в разных местах они неодинаковой толщины, часто колбовидно раздутые, клетки более или менее изогнуты, одиночные или соединены в пары или короткие цепочки (рис 2.1).

Рис.2.1 Клетки Mycobacterium

Цепочки никогда не бывают правильно очерченными и прямыми, строго расположенными в одну линию, как это наблюдается в культурах бактерий; обычно они угловато искривленные. На рисунке 2.2 показан общий вид односуточных культур разных видов микобактерий, наиболее типичных по своему строению и расположению клеток. Величина клеток микобактерий меняется в зависимости от вида культуры и состава среды. В молодом возрасте чаще всего клетки имеют длину 2,5 - 7,0 мкм [5].

Рис.2.2 Общая картина микроскопических препаратов микобактерий. Односуточные культуры на синтетической агаризованной среде.

1 - М . hyalinum ; 2 - М .rubrum; 3 - М . cyaneum ; 4 - М . bifidum ; 5 - М . citreum ; 6 - М . filiforme .

Нередко встречаются организмы, величина которых не превышает 2 - 3 и даже 1 - 2 мкм. Немало форм и с более длинными клетками, 10 - 15 мкм. Поперечник клеток у разных видов микобактерий также различен; чаще всего он равен 0,6 - 0,7 мкм. Однако нередко встречаются культуры с толщиной клеток 0,2 - 0,3 и 0,8 - 1,0 мкм. Толщина клеток микобактерий - величина более постоянная, чем длина. В культурах микобактерий более старого возраста (2 - 3 суточных) клетки укорачиваются и принимают кокковидную форму. Кокковидные клетки имеют такой же диаметр, как и палочки, или несколько больший; одиночные, или соединены в пары, или короткие кривые цепочки, или механически сцеплены в кучи. На этой стадии развития микобактерий легко можно принять за микрококки. Таким образом, микобактерий в своем развитии проходят цикл превращений из палочковидных форм в кокковидные. Поэтому, чтобы с достоверностью установить принадлежность организма к микобактериям, надо вести последовательное наблюдение за его развитием.

Другим характерным морфологическим признаком микобактерий является ветвление. Ветки образуются на боковой поверхности палочковидных клеток. Степень ветвления у разных микобактерий неодинакова: у одних клетки при благоприятных условиях образуют многочисленные ветки, по 2 - 5 на каждой клетке, у других обычно по 1 - 2 ветки. У многих видов ветвящиеся клетки встречаются вообще редко, а на некоторых средах вообще не обнаруживаются. Наконец, имеется много культур, у которых ветвление обнаруживается только при особых условиях культивирования. Например, у синих (Mycobacterium cyaneum ) и черных (Mycobacterium nigrum ) микобактерий ветвления на обычных средах (МПА, сусло-агар) не наблюдается, клетки имеют бактериальное строение; при посеве их на ломтики картофеля или в жидкие среды обнаруживается большое количество типичных ветвящихся клеток. Следовательно, ветвление у микобактерий зависит в значительной степени от питательной среды [5].

3. Особенности физиологии микроорганизмов рода Mycobacterium

Микобактерии характеризуются высоким содержанием липидов (от 30,6 до 38,9 %), вследствие этого трудно окрашиваются анилиновыми красителями, но хорошо воспринимают краску после обработки карболовым фуксином при подогревании. При таком методе микобактерии туберкулеза хорошо удерживают красители, и не обесцвечиваются при воздействии разведенных кислот, щелочей и спирта, чем отличаются от других микробов. На этом основан метод окраски микобактерии по Цилю-Нильсену.

Микобактерии с трудом окрашиваются положительно по Граму и приобретают сине-фиолетовый цвет.

Для быстрого обнаружения микобактерий в различных объектах существует люминесцентный метод, в основе которого лежит их способность окрашиваться люминесцентными красителями (родамин-аурамином) и давать золотисто-желтый цвет под воздействием ультрафиолетового излучения. Метод обладает высокой чувствительностью, дает цветное изображение возбудителя. Исследование ведется при среднем увеличении, что дает возможность просмотреть большее поле, чем при иммерсионной микроскопии под большим увеличением.

Благодаря электронной микроскопии у микобактерий выявлены трехслойная клеточная стенка, микрокапсула, цитоплазматическая мембрана. В состав цитоплазматической мембраны входят липопротеидные комплексы, различные ферментные системы, в частности, ответственные за окислительно-восстановительные процессы. Цитоплазма микобактерий представлена гранулами, вакуолями и полостями, число которых может возрастать после воздействия химических агентов.

В микрокультурах, развивающихся в жидких питательных cредах, микобактерии человеческого и бычьего видов образуют косы, жгуты, завитки, скопления. Микрокультуры легко обнаруживают при обычной микроскопии мазков, окрашенных по методу Циля-Нильсена. В препаратах, приготовленных из первичных посевов, при исследовании под фазовым контрастом обычно различают гомогенные зернистые элементы, среди которых встречаются сферические светопреломляющие структуры.

В культурах, выделенных от крупного рогатого скота, чаще находят шаровидные образования правильной формы, одинаковых размеров, а также отдельно лежащие нитевидные структуры [3].

4. Антигенная структура микобактерий

Химически сложный полисахаридолипидный комплекс (полный антиген) при парентеральном введении в иммунизированном организме вызывает образование антител, выявляемых с помощью традиционных серологических тестов РА, РСК, РП, РНГА, РИД. Полный антиген является наиболее полноценным в иммуногенном отношении для получения широкого спектра антител, тогда как ни фосфоролипидный, ни белковый, ни полисахаридный компоненты не обладают свойствами полного антигена [3].

Исследуя растворимые антигены из микобактерий Stanford и Grauge описали 4 основные группы:

- антигены Iгруппы являются общими для всех видов микобактерий и близких бактериальных родов;

- антигены IIгруппы характерны для медленно растущих микобактерий;

- антигены IIIгруппы характерны для быстро растущих микобактерий и нокардий;

антигены IVгруппы являются специфическими для отдельных видов микобактерий.

В этой связи главный вывод заключается в том, что иммунные реакции к патогенным медленнорастущим микобактериям не являются специфическими, так как это одновременно является реакцией и на антигены общие для других видов. И, наоборот, быстрорастущие микобактерии могут вызывать образование антител к антигенам патогенных микобактерий, т.е. неизбежно наличие перекрестных реакций [8].

Близкое родство видов, входящих в одну группу, определяют групповые антигены (А, В, С, Д). У всех медленнорастущих микобактерий (группа А) выявлены антигены, отсутствующие у быстрорастущих. Группа А по антигенной структуре разделена на 3 подгруппы - А_1, А₂ , А₃ . В каждой подгруппе имеется по 1 - 2 антигена, отсутствующих в других группах или подгруппах. Среди быстро растущих микобактерий имеются значительные различия в антигенной структуре и установлены 3 серологические группы (В, С, Д) [1].