Курсовая работа: Геном людини
У реалізації грандіозного проекту по розшифровці генетичного коду ДНК, який отримав назву HUGO (Human Genome Organization) взяли участь 220 учених з різних країн, у тому числі і п'ять радянських біологів. Була створена власна програма "Геном людини", керівником якої став академік Олександр Олександрович Баєв.
Вперше ідея організації подібної програми була висунута в 1986 році. Тоді ідея здалася неприйнятою: геном людини, тобто сукупність усіх його генів містить біля трьох мільярдів нуклеотидів, а в кінці 80-х років витрати на визначення одного нуклеотиду складали біля 5 доларів США. Крім того технології 80-х дозволяли одній людині визначати не більш 100 000 нуклеотидів у рік. Проте, вже в 1988 року Конгрес США схвалив створення американського проекту досліджень у цій області, керівник програми Дж. Уотсон.
Створено апарати, здатні секвенувати до 35 млн. послідовностей нуклеотидів у рік. Одним з важливих досягнень стало відкриття так називаної полімеразной ланцюгової реакції, яка дозволяє з мікроскопічних кількостей ДНК за кілька годин одержати обсяг ДНК, достатній для генетичного аналізу.
Програма приносила корисні результати. Суть робіт полягала в наступному: спочатку проводилось картування геному (визначення положення гена в хромосомі), локалізація деяких генів, а після цього секвенування (визначення точної послідовності нуклеотидів у молекулі ДНК). До 1990 року число ідентифікованих генів досягло 5000, з них картовано 1825, секвеновано - 460. Вдалося локалізувати гени, зв'язані з найтяжкими спадкоємними хворобами, такими, як хорея Гентінгтона, хвороба Альцгеймера, м'язова дистрофія Дюшена, кистозный фіброз і ін.
Коли з'явилася програма HUGO, виникли так називані геномні компанії, які зайнялися самостійно зайнялися розшифровкою геному. Як приклад можна привести американську організацію за назвою Institute of Genomic Research (TIGR) або компанію Human Genome Sciences Inc. (HGS). Так у жовтні 1994 Крек, Вентер, глава вищезгаданої компанії TIGR, повідомив, що в розпорядженні його корпорації знаходиться бібліотека з 35000 фрагментів ДНК, синтезованих за допомогою РНК на генах, отриманих лабораторним шляхом. Ці фрагменти порівняли з 32 відомими генами спадкоємних захворювань. Виявилося, що 8 з них цілком ідентичні, а 19 гомологічні. TIGR виявився власником найціннішої наукової інформації, але його керівники заявили, що хімічна будова усіх послідовностей з цієї бібліотеки засекречене і буде зроблене надбанням гласності тільки в тому випадку, якщо за компанією буде визнане право власності на всі 35000 фрагментів.
1.2 Будова геному людини
Гаплоїдний геном людини містить 3∙109 п.н. Повторювані послідовності ДНК складають близько 30%. Кількість копій цих послідовностей у геномі людини варіює від одиниць до декількох тисяч. Інші 70%, тобто приблизно 2∙109 п.н., являють собою "унікальні" послідовності, які присутні у вигляді однієї або одиничних копій. Близько 90% РНК, які транскрибуються з унікальної ДНК (мРНК), не залишає ядро клітини. Тільки 10%, що відповідає в хромосомі 2∙ 108 п.н., транспортується в цитоплазму, де відбувається трансляція. Виходячи з того, що процесована мРНК, яка кодує білок, складається в середньому з 1500 нуклеотидів, можна підрахувати, що людський геном містить інформацію для кодування близько 130000 білків (2∙108 : 1500 = 130000). Часто структурні гени, які кодують ті або інші поліпептиди, утримуються в геномі людини у вигляді декількох копій. Немає точного способу визначення частки таких генів або ступеня їхньої повторюваності. Проте є підстави думати, що число різних поліпептидів, які кодуються геномом людини, знаходиться в діапазоні від 30000 до 100000.
Для оцінки числа структурних генів у геномі людини можна запропонувати наступний підхід. Відома нуклеотидна послідовність фрагмента ДНК величиною 60000 п.н., яка містить гени β-глобінової родини (див. Рис. 1.1).
Рис1.1. Родина β -глобинових генів людини розташована в хромосомі 11. Величина представленого фрагмента хромосоми близько 60 т.п.н. Він містить п'ять функціонально активних генів (ε, Gγ , Gγ, δ и β) і два псевдогена (Ψβ2 и Ψβ2). Буквою А позначені положення Аlu-повторів-послідовностей, повторених у геномі людини близько 300 000 разів.
Цей фрагмент ДНК входить до складу одинадцятої хромосоми і містить п'ять функціональних структурних генів β, δ, A γ, G γ, і ?, які кодують чотири різних поліпептиди (два гени в кодують ідентичні білки). Таким чином, на кожен білок приходиться по 15000 (60000 : 4) пар нуклеотидів. Подібні дані отримані при вивченні генів β-глобінової родини. Фрагмент ДНК величиною 30000 п.н., розташований у шістнадцятій хромосомі, містить три функціональних гена: αl, α2 і ζ, які кодують два білки, α і ζ,. І в цьому випадку виходить те ж співвідношення-15000 п.н. на індивідуальний білок. Якщо прийняти цю цифру за середню кількість ДНК людського геному, яка приходиться на один білок, то можна зробити висновок, що гаплоїдний геном кодує 2∙109 : 1,5∙104 = 130000 індивідуальних поліпептидів. Число різних структурних генів може бути трохи менше в тому випадку, якщо середній рівень повторюваності по геному в цілому виявиться вище, ніж у генів глобінової родини.
Картування десятків тисяч генів являє собою надзвичайно важку задачу, хоча її і полегшує те, що деякі гени зібрані в групи, так називані кластери. Кластеризоване розташування мають гени глобінів, білків головного комплексу гістосумісності, імуноглобулінів. Труднощі вивчення генетики людини обумовлені тим, що аналізоване потомство нечисленне, покоління змінюються повільно, а підбор пар, природно, не піддається плануванню. Задача картування людського геному виявилася істотно полегшеною завдяки освоєнню методів роботи із соматическими клітинами.
Ген, відповідальний за колірну сліпоту (дальтонізм), був локалізований у Х-хромосомі в 1911 році. Особливості спадкування генів, зчеплених з Х-хромосомою, дозволили віднести до цієї групи зчеплення більш ніж 100 локусів. Хромосомна локалізація аутосомних генів була вперше проведена в 1968 році. Визначено розташування локусу, який кодує антигени груп крові Даффі, що, подібно антигенам групи АВО й іншим антигенам крові, знаходяться на поверхні еритроцитів. Порівняння спадкування досліджуваного гена з розподілом аберрантної хромосоми показало, що він локалізований у цій хромосомі. З тих пір на підставі аналізу родоводів визначені групи зчеплення для 70 генів людини. Картування багатьох з цих генів стало можливим після того, як було показано їхнє зчеплення з іншими генами, локалізацію яких удалося установити методами генетики соматичних кліток. Прикладом цього служить картування гена резус-фактора, уперше відкритого в 1939 році. У 1971 р. вивчення родоводів показало, що ген Rh сегрегує счеплено з геном РЕРС, якийкодує пептидазу С. Роком пізніше при вивченні соматичних клітин ген РЕРС був локалізований у хромосомі 1. Таким чином, стала відомою група зчеплення і для гена Rh, яка кодує резус-фактор. Картовано близько 500 аутосомних генів. Переважна більшість цих генів локалізовано методами генетики соматичних кліток.
За останніми даними, Міжнародний консорціум учених заявив про закінчення робіт з розшифровки генома людини. За словами глави Національного інституту по дослідженню геному людини д-ра Фрэнсиса Коллінса, дослідження завершено достроково. Програма по дослідженню послідовності генетичного коду людини, що стартувала в 1990 р., була розрахована на 15 років. У програмі по дослідженню геному людини брали участь учені, зокрема, зі США, Франції, Німеччини, Великобританії, Німеччини, Японії і Китаю.
Згідно отриманим даним, геном людини складається з 3,12 млрд пар нуклеотидів, які формують собою від 35 до 40 тис. генів. Геном може бути розшифрований тільки на 99,99%, оскільки що залишилися 0,01% є індивідуальною складовою кожної людини і не вкладаються в стандартні схеми. Остання доповідь про хід робіт з дослідження геному людини була зроблена д-ром Ф.Колінсом у 2000 р. На той момент вченим удалося розшифрувати геном людини на 97%. Керівник інституту також заявив, що незабаром результати робіт будуть представлені міжнародної наукової громадськості.
РОЗДІЛ ІІ . МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ГЕНОМУ ЛЮДИНИ
2.1 Гібридизація клітин у культурі
У I960 р. було показано, що при спільному культивуванні клітин двох різних ліній вони можуть зливатися, утворювати гібриди, які містять геноми обох батьківських форм. Перші гібридні клітини були отримані при злитті клітин різних ліній мишей, які культивувались Крім внутрішньовидових отримані і міжвидові гібриди, наприклад, між клітинами людини і миші, миші і хом'ячка і навіть миші і курчати.
Утворення гібридних клітин відбувається набагато частіше, якщо в культуру додані деякі речовини, наприклад поліетиленгліколь або інактивовані віруси. Для цієї мети часто використовують вірус Сендай. У вірусів звичайно є один і більш специфічних ділянок, завдяки яким вони можуть зв'язуватися з рецепторами клітини-хазяїна. На поверхні вірусу Сендай таких ділянок небагато. Таким чином, одна вірусна частка здатна утворити місток, з'єднавшись відразу з двома клітинами. Внаслідок дуже малого розміру вірусної частки клітини виявляться надзвичайно тісно зближені. При цьому може відбутися злиття плазматичних мембран клітин і утворитися дикаріон - клітина з двома ядрами. Потім ядра також можуть злитися з утворенням синкаріону, якиймістить хромосоми обох батьків. По незрозумілим причинах протягом декількох перших розподілів гібридної клітини відбувається швидка втрата хромосом одного з поєднуваних видів. У клітинних гібридів миша-хом'ячок відбувається втрата хромосом миші. У гібридів кліток миші і людини втрачаються хромосоми людини. Звичайно через 30 поколінь гібридна клітинна лінія миша-людина містить повний хромосомний набір миші і тільки сім людських хромосом. Ця цифра є середньою, деякі клітини містять тільки одну-дві пари людських хромосом, тоді як інші 20. Одна клітинна лінія, хромосоми якої втрачаються після злиття, називається донорною, а інша - реципієнтною. Варіабельність втрати хромосом людини в клітинних гібридів мишей-людин полегшує картування людських генів. Для картування генів миші використовують клітинні гібриди миша-хом'ячок. Якщо присутність продукту досліджуваного гена корелює з наявністю якої-небудь однієї хромосоми в гібриді, то цей ген, швидше за все, локалізований у цій хромосомі. Повинні дотримуватися дві умови. По-перше, досліджувана ознака, яка кодується хромосомами людини, повинна чітко (на клітинному рівні) відрізнятися від аналогічної ознаки миші. Наприклад, досліджувана лінія клітин людини містить мутантну лактатдегідрогеназу A (LDH-A). Цей фермент відрізняється від білка, який кодується відповідним мишачим геном. Ці дві форми легко розділяються при гель-електрофорезі. Друга умова, необхідна для картування - можливість ідентифікації даної людської хромосоми, яка присутня у досліджуваній клітинній лінії.
Зчеплення генів у соматичних клітках запропоновано називати синтенією, від грецького "син" - спільно, "тіні"-підтримувати. Цей термін уведений для того, щоб відрізняти дані про хромосомну локалізацію, отримані в дослідах із соматичними клітинами, від результатів по зчепленню генів, отриманих при аналізі родоводів. Якщо два гени присутні або обоє відсутні в гібридних клітинних лініях, то вони називаються синтеничними.
2.2 Відбір клітинних гібридів за допомогою методу НАТ
Втрата хромосом у гібридів між клітинами миші і людин - це випадковий процес. Те, яка хромосома збережеться і стабілізується в гібридній лінії, випадковий процес. Однак із усієї популяції гібридних клітин можна відібрати стабільні лінії, які містять бажані гени і хромосоми, використовуючи селекційні методи. Ці процедури аналогічні тим, що використовуються для добору певних класів рекомбінантів, які утворяться при схрещуваннях бактерій або дріжджів.
Відсутність у батьківської лінії мишачих клітин якої-небудь істотної функції, наприклад здатності синтезувати необхідний метаболіт, може бути супресовано при внесенні елементів геному людини. З такої гібридної лінії можуть поступово втратитися всі людські хромосоми, крім тієї, котра містить ген, відповідальний за незамінну функцію. Таким чином, можна відібрати гібридні клони, які містять конкретні людські хромосоми. Такий попередній добір полегшує картування генів, розташованих у цій хромосомі.
Один дуже широко використовуваний метод добору гібридних кліток називається НАТ-селекцією. Це назва-абревіатура англійських назв речовин: гіпоксантина, аміноптерина і тимідина, які присутні у селективному середовищі. Аміноптерин блокує синтез пуринів і піримідинів. Для того щоб синтезувати ДНК, клітини повинні реутилізувати пурини і піримідини, які утворяться при деградації полінуклеотидів. В обміні нуклеотидів бере участь велика кількість ферментів. Один з цих ферментів - тимідинкіназа (ТК), яка здійснює перетворення тимідину в тимідинмонофосфат. Якщо у мутантній лінії клітин миші, яка використовується відсутній цей фермент, то на селективному середовищі HAT, в якому відсутній тимідинмонофосфат, можуть рости клітини, які одержали хоча б одну з гомологічних хромосом людини, які містять ген ТК. Цитологічні дослідження показали, що всі клітинні лінії, які відбираються, містять 17 хромосому людини. За допомогою таких клітинних ліній можуть бути картовані й інші гени людини (крім гена ТК), локалізовані на сімнадцятій хромосомі. Задача зводиться до ідентифікації продуктів генів людини, що напрацьовуються у відібраних гібридних лініях.
Селективне середовище HAT може бути використана для добору клонів, які містять і інші хромосоми. Наприклад, фермент фосфорибозил-гіпоксантин-трансфераза (HPRT) бере участь у синтезі пуринів. Якщо лінія кліток миші втрачає здатність синтезувати HPRT, то цей дефект може бути відшкодований присутністю відповідного гена людини. Показано, що всі гібридні клони, відібрані за цією ознакою, містять людську Х-хромосому, у складі якої знаходиться ген HPRT. Розроблено інші селективні схеми, що дозволяють проводити картування генів, локалізованих і на інших хромосомах, крім X і 17.
2.3 Внутрішньохромосомне картування генів за допомогою хромосомних перебудов
Ідентифікація індивідуальної хромосоми, у якій знаходиться досліджуваний ген - це тільки перший етап картування. Основною задачею є встановлення порядку генів і їхня точна локалізація. У деяких випадках метод аналізу родоводів дозволяє розташувати на генетичній карті хромосоми три і більш маркерів. Використання більш ефективних методів генетики соматичних кліток може дати більш точну інформацію. Істотна допомога в таких дослідженнях належить хромосомним перебудовам.
Ген, який кодує кислу фосфатазу 1 (ACPI) еритроцитів, розташований на другій хромосомі. При цитологічному вивченні каріотипів двох дітей (із двох різних родин), у яких були множинні уроджені аномалії, далося показати наявність делецій термінальної області короткого плеча другої хромосоми. В одного з дітей делеція хромосоми починалася з термінального району смуги 2р23. Культура клітин, отриманих від цієї дитини, мала ACPI-активність. Ці клітини несли алель А в одній з гомологічних хромосом і аллель В в іншій. У другої дитини делеція захоплювала і проксимальний район смуги 2рЗЗ. Клітини, які містять таку хромосому, були позбавлені активності цього ферменту. Таким чином, можна зробити висновок, що ген ACPI локалізований у смузі 2р23.
У клітинах, які культивуються часто виявляються хромосомні перебудови, відсутні в індивідуумів, які служили донорами вихідних клітин. В інших випадках перебудови, наприклад транслокації, уже присутні в мутантних організмах.