Взаимное расположение линий преципитации: сравнительный анализ

Для выявления полной или частичной идентичности в геле обычно вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из низ помещают сравниваемые растворы антигенов, а в третью – антисыворотку.

Если линии полностью сливаются, то антигены полностью идентичны. Если линии пересекаются, то антигены не идентичны. Если одна из линий длиннее другой, и выходя из нее образует шпору, то антигены частично идентичны. Оба антигена имеют некоторые общие детерминанты, но у одного антигена имеются детерминанты, которых нет у второго, именно они образуют шпору. Если две линии преципитации пересекаются, частично сливаясь, антигены имеют как одинаковые, так и различные детерминанты.

1.4. Определение титра

Готовят последовательные двукратные разведения изучаемого антигена и равные объемы каждого разведения вносят в лунки, расположенные по периферии той лунки, в которой антисыворотка (стандартный объем). При оценке результатов иммунодиффузии учитывают:

1. расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферических лунок;

2. последнее разведение антигена, которое еще дает видимый преципитат;

3. интенсивность и ширину полос преципитации.

Последнее разведение антигена, дающее преципитат, считают его титром. Подобным образом можно титровать содержание антител в антисыворотке.

1.5. Область применения

Качественный анализ, например для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными.

Метод обладает высокой специфичностью, при количественных вариантах иммунодиффузии ошибка метода составляет 3-7%.

2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену

2.1. Принцип

Гель, содержащий антисыворотку, помещают в стеклянные трубки или пробирки. Трубки вертикально погружают в раствор антигена, и в пробирках раствор антигена наслаивают на гель. Антигены диффундируют в гель со скоростью, пропорциональной их концентрации, и, соединившись со специфическими антителами, образуют с ними беловато-мутные преципитаты. Число линий преципитации зависит от числа реагирующих систем антиген-антитело. Чем продолжительнее диффузия, тем дальше фронт преципитации каждой линии удаляется от границы, разделяющей гель и жидкость. Расстояние, которое он проходит за определенное время при строго постоянной концентрации антисыворотки в геле, зависит только от концентрации диффундирующего антигена. При постоянных условия опыта (температура, серия антисыворотки и ее концентрация в геле, концентрация самого геля) с помощью простой линейной иммунодиффузии можно определять количество антигена.

2.2. Проведение иммунодиффузии

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки, стандартные растворы антигенов и рабочий стандарт, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1. Специальный агар Noble; стеклянные капилляры для определения гематокрита длиной около 50 мм, с внутренним диаметром 1-1,5 мм; измерительная лупа с точностью до 0,1 мм.

В стеклянные капилляры насасывают и выдувают обратно 1%-ный горячий золь агара на воде. Затем капилляры высушивают при 70°С. Образовавшаяся агаровая пленка усиливает сцепление геля со стеклом и препятствует образованию щелей, в которые мог бы проникнуть антиген.

В 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендируют 2 г сухого агара и нагревают на водяной бане до расплавления. Агар охлаждают до 48°С и смешивают с равным объемом подогретой до 48°С антисыворотки. В эту смесь погружают капилляры, с тем чтобы она заполнила их на 2-3 см. Когда гель затвердеет, капилляры готовы к употреблению.

Капилляры погружают в растворы антигенов, но перед погружением капилляров в антиген следует довести температуру всех реагентов до нужной величины, например до 4°С. Реакция длится 48 ч. Затем измеряют расстояние, которое прошел фронт преципитации в каждом капилляре.

Для того, чтобы антиген мог диффундировать в гель, содержащий антитела, он должен быть в избытке. Скорость миграции преципитата К можно вычислить, разделив расстояние h, на квадратный корень из времени диффузии t.

При постоянном времени диффузии между логарифмом концентрации антигена и расстоянием, которое проходит фронт преципитации, существует прямая линейная зависимость. Наклон калибровочной кривой прямо пропорционален квадрату коэффициента диффузии антигена и обратно пропорционален концентрации антител в геле и вязкости геля.

Оценка метода

Критическим фактором является температура. Продолжительность инкубации зависит от величины диффундирующих молекул, чаще всего длится 12, 24 или 48 часов.

3. Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини

3.1. Принцип

На ровную поверхность равномерным слоем наносят гель, содержащий антитела. В геле вырезают лунки и заполняют их раствором антигена. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации.

3.2. Проведение исследования

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки; стандартные растворы антигенов; рабочий стандарт; веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1; агар; рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, кюветы для элюции из комплекта для электрофореза; измерительный инструмент с точностью до 0,1 мм; микрошприц.

Нагревают 1,5 г агара до полного расплавления в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяной бане и, охладив до 48°С, смешивают в нужной пропорции с антисывороткой, подогретой до той же температуры. Смесь разливают по 2 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально. Золь должен равномерно распределиться по поверхности стекла. Чтобы усилить сцепление геля со стеклом, рекомендуется предварительно покрыть стекло тонкой агаровой пленкой.

В пластинке геля вырезают лунки, рассчитанные на 2 мкл антигенного раствора каждая. После внесения антигена пластинки геля помещают во влажную камеру и проводят иммунодиффузию при комнатной температуре. Кольца преципитации можно измерять прямо на влажной пластинке. Если преципитаты видны недостаточно четко, то сначала элюируют непреципитировавшие белки в двух сменах 0,15 М раствора NaCl по 12 ч, затем гель высушивают и окрашивают красителями, например амидо-черным, и высушивают вновь.

Площадь, занимаемая преципитатом к концу диффузии, прямо пропорциональна исходной концентрации антигена в лунке. Для построения калибровочной кривой берут либо площадь преципитата как функцию концентрации антигена, либо логарифм диаметра преципитата как функцию логарифма концентрации антигена:

S=K*Q_{A Г} +S₀ ,

где S – площадь преципитата, включая S₀ , S₀ – площадь стартовой лунки и Q_{A Г} -- количество антигена.

Наклон К полученной прямой обратно пропорционален концентрации антител в геле. Уменьшив содержание антисыворотки в агаре, можно увеличить К. В результате возрастет диаметр преципитата, что повысит чувствительность и экономность метода. Оптимальная концентрация антисыворотки в геле зависит прежде всего от титра антител.