Курсовая работа: Репликация, сохранение и модификация генома
Начало репликации. Репликация ДНК начинается не в любой случайной точке молекулы, а в специфических местах, называемых точками начала репликации. Процесс копирования продолжается через образование репликативных вилок в одном или обоих направлениях до тех пор, пока ДНК полностью не удвоится. В замкнутых кольцевых дуплексах ДНК новосинтезированные цепи ковалентно соединяются в местах встречи увеличивающихся в размере репликативных вилок или в том месте, где единственная вилка возвращается к точке начала репликации. Дочерние молекулы, как правило, расходятся еще до начала нового раунда репликации. Такие различающиеся по размеру геномы, как геном вируса SV40, бактериофага X и E. coli, воспроизводятся в результате одного инициирующего события, происходящего в определенной точке.
У про - и эукариот можно встретить различные вариации на эту тему. Так, каждая из цепей родительской спирали митохондриальной ДНК животных и ДНК плазмиды ColE1 имеет свою точку начала репликации. Синтез комплементарной цепи некоторых небольших одноцепочечных фаговых геномов начинается вблизи одной специфической последовательности, а репликация полученного дуплекса может инициироваться совсем в другой точке. Репликация линейных дуплексных ДНК также инициируется в особых сайтах. Например, ДНК бактериофага Т7 реплицируется в двух противоположных направлениях к разным концам молекулы, начиная от одной точки, а каждая из двух цепей ДНК аденовируса человека реплицируется последовательно всегда от З'-конца.
Для геномов эукариотических клеток обычно характерно наличие множественных точек начала репликации, разбросанных по хромосоме на расстоянии 20 т.п. н. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор, пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких, независимо инициированных новосинтезированных цепей.
Скорость репликации генома. Скорость репликации генома регулируется в основном частотой инициирующих событий. Так, у Е. coli скорость копирования в каждой репликативной вилке постоянна и равна примерно 1500 п. н. в секунду; следовательно, полный геном длиной 4*106 пар реплицируется примерно за 40 мин. Если хромосома реплицируется быстрее, это значит, что увеличивается частота актов инициации в той же самой точке начала репликации при прежней скорости копирования. Клетки Е. coli делятся каждые 20 мин; это означает, что репликация ДНК инициируется в хромосомах, еще не закончивших предыдущий раунд репликации. Скорость движения репликативной вилки в эукариотических клетках значительно меньше, но завершение репликации хромосомы в разумное время обеспечивается одновременной инициацией во множестве точек. Итак, скорость репликации хромосом контролируется числом и расположением точек начала репликации. Например, в ранних эмбрионах дрозофилы репликация хромосомы осуществляется каждые 3 мин благодаря почти одновременной инициации событий в точках, отстоящих друг от друга на 7000-8000 п. н. В культуре клеток Drosophila наблюдается значительно более медленная скорость дупликации хромосомы, поскольку репликация начинается в гораздо меньшем числе точек, находящихся друг от друга на расстоянии 40000 п. н. Следовательно, при фиксированной скорости роста цепи множественная инициация обеспечивает большую скорость процесса и уменьшает время, необходимое для дупликации протяженных участков хромосом.
Структура точек начала репликации. Фрагменты ДНК, несущие точку начала репликации, выделены из Е. coli и некоторых колифагов и плазмид, а также из дрожжей и ряда эукариотических вирусов. В некоторых случаях место начала репликации имеет такую нуклеотидную последовательность, что дуплекс принимает необычную конфигурацию, которую распознают белки, участвующие в инициации. Природа взаимодействия между точкой начала репликации и белками и механизм инициации в целом исследованы очень мало, однако можно сказать, что, по-видимому, они в разных случаях различны.
в. Репликация ДНК полуконсервативна
После начала репликации репликативные вилки движутся в одном или обоих направлениях вдоль молекулы ДНК. Чем дальше продвинулась вилка, тем длиннее новосинтезированный сегмент ДНК. Прежде чем обсуждать данные о механизмах инициации репликативной вилки и ее движения, полученные с помощью модельных систем репликации у прокариот, рассмотрим основную реакцию, протекающую в репликативной вилке в процессе копирования двухцепочечной ДНК.
Цепи ДНК синтезируются в результате присоединения 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к З'-гидроксильному концу уже имеющейся цепи. Следовательно, они синтезируются в направлении 5'->3'вдоль матричной цепи, ориентированной в противоположном, 3'->5', направлении. Синтез цепей в обратном направлении не происходит никогда, поэтому синтезируемые цепи в каждой репликативной вилке должны расти в противоположных направлениях. Синтез одной цепи происходит непрерывно, а другой - импульсами. Такой механизм репликации называется полунепрерывным. Ведущая цепь растет от 5' - к 3'-концу в направлении движения репликативной вилки и нуждается только в одном акте инициации. Рост отстающей цепи также идет от 5' - к 3'-концу, но в направлении, противоположном движению репликативной вилки. Для синтеза отстающей цепи должно произойти несколько актов инициации, в результате чего образуется множество коротких цепей. Эти цепи, называемые фрагментами Оказаки в честь открывшего их ученого, имеют размеры 1000-2000 нуклеотидов у прокариот и 100-200 в реплицирующейся ДНК эукариот. По мере движения репликативной вилки концы соседних фрагментов Оказаки соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи.
Механизмы инициации репликации в точке начала репликации и при образовании фрагментов Оказаки в отстающей цепи в принципе аналогичны, хотя имеются некоторые тонкие различия. В обоих случаях происходит образование коротких РНК-затравок, комплементарных матричной ДНК, в виде продолжения которых синтезируется новая цепь ДНК. В дальнейшем короткие вставки РНК замещаются сегментами ДНК, которые затем объединяются с образованием непрерывной отстающей цепи.
г. Комплементарное копирование оснований, перенос дезоксинуклеотидов и лигирование ДНК при репликации
Нуклеотидная последовательность матричной цепи задает порядок расположения нуклеотидов в новосинтезируемых цепях ДНК. Несмотря на то что правило комплементарности обеспечивает большую надежность процесса копирования, последний небезошибочен. Из-за случайных флуктуации в структуре присоединяемых оснований и оснований, входящих в состав матричной цепи, могут происходить ошибочное спаривание и включение неправильных нуклеотидов. При включении неправильного нуклеотида дальнейший рост цепи обычно останавливается. Ферменты, катализирующие присоединение нуклеотидов, обладают эффективной системой коррекции - они удаляют включенный, но неспаренный нуклеотид почти сразу после присоединения его к концу растущей цепи. В общем виде реакцию присоединения 5'-дезоксинуклеотидной группы к З'-ОН-группе концевого нуклеотида праймерной цепи можно представить следующим образом:
„ + dNTP <=> m 1 + PP,
где dNMP-любой из четырех обычных нуклеотидов. За один акт репликации праймерная цепь удлиняется на один остаток, при этом одновременно происходит удаление пирофосфата. Реакция присоединения нуклеотида обратима, но в целом она смещена в сторону синтеза, поскольку неорганический фосфат в клетках быстро разрушается. Ферменты, катализирующие праймер-зависимую, детерминируемую ДНК-матрицей реакцию присоединения дезоксинуклеотидов, называются ДНК-полимеразами. Многие ДНК-полимеразы выделены и охарактеризованы.
Фрагменты Оказаки, образующиеся при импульсном копировании цепи ДНК, должны впоследствии объединиться в непрерывную отстающую цепь. Эта реакция осуществляется ДНК-лигазами - ферментами, катализирующими ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе; ДНК-лигазы играют ключевую роль не только в репликации, но и в репарации повреждений и рекомбинации ДНК.
д. Ключевые ферменты, участвующие в синтезе ДНК
Многие известные теперь детали процесса репликации ДНК удалось установить благодаря исследованию поведения и активности ферментов, обеспечивающих работу аппарата репликации. Наиболее полно изучен механизм репликации бактериальной ДНК, особенно ДНК Е. coli и бактериофагов, которые в ней размножаются. Довольно хорошо известны и ферменты репликации дрожжей, Drosophila, клеток и вирусов млекопитающих. Здесь мы обсудим механизм действия ДНК-полимераз и ДНК-лигаз, поскольку при синтезе длинных цепей ДНК эти два фермента работают согласованно.
ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы присутствуют во всех прокариотических и эукариотических клетках. Более того, многие вирусы бактерий и животных индуцируют образование вирус-специфических ДНК-полимераз или белков, способствующих эффективному участию ДНК-полимераз клеток-хозяев в репликации вирусной ДНК. Некоторые прокариотические и эукариотические ДНК-полимеразы выделены в чистом виде, а их физические и ферментативные свойства охарактеризованы. И хотя эти свойства не совсем идентичны, механизм катализа для всех указанных ферментов в общих чертах одинаков.
Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I E. coli. Она представляет собой одиночный полипсптид с мультифункциональными активностями. В качестве ДНК-полимеразы Pol I катализирует перенос 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов к 3'-ОН-группе в цепи ДНК или РНК, после чего происходит спаривание перенесенного основания с соответствующим основанием комплементарной цепи ДНК. Таким образом, для полимеризации ферменту необходимы праймер в качестве дезоксинуклеотидного акцептора и матрица, детерминирующая присоединение нужного нук-леотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Pol I катализирует две другие реакции, биологическая роль которых очень важна. В одной из них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с З'-конца цепи. Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5'-конца дуплексной ДНК в направлении к 3'-концу. Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидной цепи PolI. Если invitro обработать Pol I трипсином, то полипептидная цепь расщепится на большой и малый фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент сохраняет ДНК-полимеразную и 3'-5'-экзонуклеазную активности; малый, N-концевой фрагмент обладает только 5'-3'-экзонуклеазной активностью.
PolI и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК E. coli.3'-5'-экзонуклеаз-ная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем PolI, то при репликации генома часто происходят мутации - замены оснований.
Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-ко-нец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей цепи. PolI удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку PolI способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двухцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва. этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК. Ник-трансляция широко используется invitro для синтеза радиоактивно меченной ДНК.
У Е. coli имеются и две другие ДНК-полимеразы, но они присутствуют в клетке в меньших количествах. PolII присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем PolI, и не обладает 5'-3'-эк-зонуклеазной активностью. Следовательно, PolII может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль PolII в репликации и сохранении хромосомной ДНК E. coli до настоящего момента неясна.
PolIII-холофермент - это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК E. coli. В каждой клетке содержится только 10-20 копий PolIII-холофермента, и тем не менее он является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки. Но поскольку PolIII-xo-лофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие PolI, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии Pol III, и удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов Оказаки.
Обнаружены изменения в полипептидной цепи основного фермента Pol III, известны аминокислотные замены, которые позволяют приписать определенные виды ферментативной активности конкретным субъединицам ферментного комплекса. Так, а-субъединица обладает полимеразной активностью, а £-субъединица - 3'-5'-экзонуклеазной. Однако комплекс а - и £-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, 9-субъединицы пока неясна.
Помимо субъединиц, составляющих PolIII-кор, PolIII-холофермент содержит еще семь субъединиц: т, у, в, б, б', х и г|). Перечисленные полипептиды также существуют во множестве копий, так что в результате мол. масса комплекса составляет примерно 103 кДа. Роль в-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования; точная же функция других субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что
PolIII-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой - прерывистой отстающей.
PolIII-холофермент катализирует те же реакции синтеза, что и PolI, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, PolIII-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. PolIII-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации. На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках, инициирующие образование праймерных РНК, обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК.
ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бактериями и многими бактериофагами, различаются по своим физической структуре и свойствам. Тем не менее катализируемые ими реакции практически идентичны реакциям, изученным у Е. coli. У всех ДНК-полимераз есть корректирующая 3'-5'-экзо-нуклеаза, однако 5'-3'-экзонуклеаза у некоторых ферментов отсутствует. Например, ДНК-полимераза фага Т4 может осуществлять 3'-5'-экзонук-леазную реакцию коррекции ошибок, но не способна катализировать 5'-3'-экзонуклеазную реакцию и поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При репликации ДНК фага Т4 5'-3'-экзонуклеазную реакцию удаления РНК-праймеров перед объединением фрагментов Оказаки катализирует другой кодируемый фагом белок. В процессе прерывистого синтеза отстающих цепей и репарации повреждений ДНК фага Т4 этот фермент работает согласованно с фаговой ДНК-полимеразой.
В эукариотических клетках идентифицировано множество ДНК-полимераз, но их физические и функциональные свойства изучены менее детально, чем у соответствующих ферментов прокариот. Из клеток млекопитающих выделены четыре ДНК-полимеразы: а, в и б содержатся в ядрах, а у - в митохондриях. ДНК-полимераза а участвует в репликации хромосомной ДНК. Ее полимеразная активность связана с большим полипептидом, но она существует и, возможно, функционирует как муль-тисубъединичный белок, аналогично PolIII-холоферменту E. coli. в-Полимераза - это одиночный полипептид, функцией которого является заполнение пробелов при репарации повреждений ДНК. Митохондриальная полимераза у, состоящая из четырех идентичных полипептидов, ответственна за репликацию митохондриального генома. б-Полимераза похожа на полимеразу а по своим молекулярным и синтетическим свойствам и также участвует в репликации хромосомной ДНК. Поскольку а-, в - и у-ДНК-полимеразы млекопитающих лишены 3'-5' - и 5'-3'-экзонуклеазных активностей, присущих ферментам Е. coli, остается неясно, как в процессе репликации ДНК у этих организмов удаляются случайно включенные ошибочные нуклеотиды и РНК-затравки на концах фрагментов Оказаки.
Некоторые вирусы животных индуцируют синтез особых полимераз для репликации своих геномов. Другие вирусы образуют белки, которые стимулируют системы репликации клеточной ДНК или участвуют в репликации вирусной ДНК. Например, паповавирусы синтезируют белки, необходимые для инициации репликации. Аденовирусы человека кодируют белки, "запускающие" инициацию синтеза обеих цепей линейной вирусной ДНК. Они продуцируют также особые ДНК-связывающие белки, облегчающие репликацию.
ДНК-лигазы. ДНК-лигазы необходимы для соединения цепей ДНК при репликации, репарации и рекомбинации. Все известные лигазы способны образовывать фосфодиэфрные мостики между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрывов ДНК. ДНК-лигаза, индуцируемая в E. coli после заражения клетки фагом Т4, уникальна по своей способности соединять двухцепочечные фрагменты ДНК по концам разрыва. Физиологическая роль этой реакции неизвестна, но практическое ее значение в манипуляциях с рекомбинантной ДНК неоценимо.
ДНК-лигазы некоторых бактерий, бактериофагов и млекопитающих выделены и их структура и механизм каталитической активности установлены. ДНК-лигазы Е. coli, T4 и Т7-это одиночные полипептидные цепи, либо АТР, либо его производного - никотинамид-адениндинуклеотида. Реакция протекает в несколько этапов:
1) аденилильная единица NAD или АТР переносится на £-аминогруппу лизинового остатка лигазы с одновременным высвобождением никотинамидмононуклеотида или неорганического фосфата соответственно;