Курсовая работа: Выделение споровых микроорганизмов грунта пещеры Баскунчакская (Астраханской области)
При первых двух отборах среди изучаемых групп микроорганизмов наиболее представительными были гетеротрофные бактерии и актиномицеты. В числе гетеротрофов доминируют бациллы: Bac.megaterium, Bac.suрtiles, Bac.mesentericus.
Микроскопические грибы практически отсутствовали в грунте пещеры и были немногочисленны в воздухе. Микрофлора, выделявшаяся на среде Тамия, была представлена, в основном, автотрофными микроорганизмами (растущими на минеральном субстрате). Микроводоросли на период 06.04.-16.07.90г. обнаружены не были. Численность микроорганизмов в указанный период была на 1-2 порядка выше в грунтах, чем в воздухе
Результаты третьего обследования, 20.09.90 г. показали: тенденция к нарастанию микроорганизмов по исследуемым группам микрофлоры сохранилась. Особенно возросла численность грибов и гетеротрофных микроорганизмов, плотность которых отмечалась на площадке у входа. По - видимому, эта закономерность является результатом эксплуатации пещеры в качестве экскурсионного объекта.
Недавние исследования, проведенные в Туркменистане и южных районах США, показали, что неконтролируемое посещение пещер приводит к накоплению в них опасных для человека бактерий, в первую очередь - возбудителей кишечных и легочных инфекций. В пещерах Средней Азии, кроме этого, обнаружены патогенные грибы р.р. Penicillium, Aspergillus, Nannizzia. Несмотря на то, что в Красноярском крае имеются десятки активно посещаемых пещер, микробиологический мониторинг в них полностью отсутствует.
Для выделения бактерий и грибов, представляющих естественную микрофлору пещеры, использовали среды МПА и модифицированную среду Чапека. Культивирование осуществляли при температуре +3 °С, что соответствует естественным условиям пещеры и предотвращает рост мезофильных микроорганизмов, случайно занесенных с поверхности. Учет численности микроорганизмов и описание колоний проводили через 3-4 недели культивирования (http:⁄⁄ www.ecocave.ru).
Для учета санитарно-показательных микроорганизмов (бактерии группы кишечной палочки) использовали среду Эндо, учет результатов проводили через 2 суток культивирования при температуре +37°С. Учитывали окрашенные в красный цвет колонии, состоящие из грам-отрицательных, оксидазоотрицательных палочек (http:⁄⁄ www.ecocave.ru).
Проведенные нами исследования показали, что в пещере Большая Орешная присутствуют, по крайней мере, три различные группы микроорганизмов(http:⁄⁄ www.ecocave.ru).
Первая группа - это психрофильные бактерии, являющиеся естественными обитателями пещеры. Их численность варьирует в пределах 104 - 106 микробных клеток на 1 г грунта в зависимости от места взятия образца. Среди бактерий данной группы отмечены представители р. Arthrobacter, Pseudomonas и др. Очевидно, данные бактерии безопасны для человека в силу неспособности к росту при температуре человеческого тела, однако представляют несомненный научный интерес (http:⁄⁄ www.ecocave.ru).
Вторая группа - это мезофильные бактерии, особенно многочисленные в активно посещаемых участках пещеры. Численность мезофильных бактерий в некоторых пробах воды составила до 105 микробных клеток на 1 мл. Следует предположить, что бактерии данной группы занесены с поверхности человеком. Особое беспокойство вызывает обнаружение в пробах грунта и воды бактерий группы кишечной палочки в количествах, в десятки и сотни тысяч раз превышающих санитарные показатели. Это свидетельствует об исключительно высоком уровне фекального загрязнения пещеры и как следствие - о непригодности многих источников воды для питья.
Третья группа выявленных в пещерах микроорганизмов представлена плесневыми грибами р. Penicillium, Mucor и др. Данные микроорганизмы в значительном количестве (104 - 105 клеток/гм грунта) присутствуют в гротах с высоким уровнем антропогенного загрязнения. В остальных участках пещеры грибы обнаруживаются в виде единичных колоний размером от нескольких мм до десятков см преимущественно на высокомолекулярных субстратах. Учитывая, что среди представителей выявленных родов встречаются возбудители микозов человека, высокая концентрация плесневых грибов вблизи подземных стоянок спелеотуристов может представлять реальную опасность. Таким образом, по крайней мере, две группы микроорганизмов, обнаруженных в пещере Большая Орешная, могут представлять угрозу для здоровья посетителей пещеры (http:⁄⁄ www.ecocave.ry).
Воронцовская система пещер, расположена на территории Сочинского национального парка, ее официальное экскурсионное освоение начато с 2000 года ООО "Воронцовские пещеры". Этот район всегда активно посещался спелеотуристами, с некоторой неравномерностью в течение года. Пик посещений приходился на новогодние праздники и зимние студенческие каникулы, майские праздники, а также летние месяцы, т. е. периоды традиционных спелеовыездов. После того, как была проложена асфальтовая дорога и оборудованы пещеры, район стал более доступным, что привело к увеличению количества туристов. Особенно велика антропогенная нагрузка в летние месяцы. В течение многих лет исследованием Воронцовского карстового участка занималась секция спелеологии Санкт-Петербургского горного института. Ими проводилась гидрогеологическая и гидрохимическая съемка района (Ю. С. Ляхницкий, 2003 г; "Карст и пещеры Кавказа"), однако микробиологическое загрязнение не учитывалось.
Во время проведения спелеоклубом МГУ спелеошколы была начата работа по оценке антропогенного влияния на Воронцовскую систему пещер. С целью предварительной оценки микробиологического состояния пещеры было проведено определение количественного и качественного состава микрофлоры воды в пещерах и на поверхности. Точки отбора проб выбирали таким образом, чтобы охватить как активно посещаемые, так и труднодоступные участки пещеры, а также с учетом общего водотока района и возможных поверхностных источников загрязнений.
Помимо источников на поверхности были взяты пробы из грота Прометей, Грота Пантеон, Грота Очажный, Хода Жилина, Разгрузочного района, Обвального зала из Главной галереи, пещер Долгой и Кабаний провал.
Были выбраны стандартные критерии оценки: общее количество бактериальных клеток и количество клеток бактерий группы кишечной палочки в единице объема воды; а также состав мезофильной флоры.
Определение общего числа клеток проводили методом прямого подсчета клеток в окрашенных мазках.
Наличие и численность бактерий группы кишечной палочки определяли методом высева на чашки со средой MacConkey s agar при температуре 36 С.
Количественную обработку данных проводили с использованием статистики Пуассона.
Качественный анализ проводили, высаживая, бактерии на селективные среды при температуре 25-36С с целью определения видов, находящихся в состоянии покоя, но представляющих потенциальную опасность для человека. В результате определен следующий состав мезофильных микрорганизмов: Streptomyces; Pseudonocardia; Nocardioides; Acinetobacter; Pseudomonas; Arthrobacter; Bacillus.
Количество бактерий группы кишечной палочки в разных пробах колеблется от 0.1 до 4 клеток на мл, что превышает допустимые нормы для питьевой воды (на 1 литр 3 шт. - 0.003 на 1 мл), но не превышает нормы для технической воды (5000 на 1 литр - 5 на мл). Общее содержание бактерий для питьевой воды в норме 100 на 1 мл, в Воронцовской системе пещере этот показатель превышен в среднем в 3-4 раза. Можно говорить об общем загрязнении водотока района. Для определения источников загрязнения планируется провести учет туристических стоянок и прочих возможных источников загрязнения на поверхности, а также повторные микробиологические исследования. Особое внимание было уделено состоянию оборудованной части пещеры, это участок от грота Прометей до грота Пантеон.
В местах нахождения ламп на известняке образовались сизые пятна грибов, растущих по стенам, размеры пятен достигают полуметра, особенно сильно они развиваются если лампы установлены в нишах, за выступами породы, где плохая вентиляция. Грибы определены как представители рода Penicillium. Также под лампами обнаруживается так называемая "ламповая флора", в состав которой входят сине-зеленые, диатомовые водоросли и даже мхи.
В условиях карстового ландшафта существуют потоки вещества и энергии между наземными элементами ландшафта и глубинным карстом. Несмотря на это, пещерные местообитания характеризуются рядом специфических условий, существование которых должно приводить к изменениям характеристик экологической целесообразности жизнедеятельности организмов.
Прежде чем приступить к анализу экологических условий пещерных местообитаний, мы задали себе вопрос о путях возможной эволюции в пещерах. С одной стороны, это может быть "эволюция смерти", когда происходит выживание организмов, обладающих максимальной резистентностью, а структура сообществ при этом деградирует. С другой стороны, это может быть "эволюция жизни", когда происходят последовательные изменения, приводящие к формированию адаптированных видов, не похожих на наземные аналоги.
В первом случае таксономический набор пещерных видов не будет сильно отличаться от характерной зональной флоры и фауны. Второй случай реализуется, если под землей содержатся нетривиальные источники энергии, или экстремальные местообитания, или, если карст прошел длительную эволюцию, на последних стадиях которой связи с дневной поверхностью были ослаблены. Все три варианта имеют место, например, в реликтовых полостях на большой глубине в аридных регионах.
Переходя теперь конкретно к пещерам Пинеги, попробуем сформулировать: какие же именно факторы составляют специфичность пещерных местообитаний.
Во-первых, следует рассмотреть степень олиготрофности. Мы полагаем, что, несмотря на кажущуюся обедненность органическим веществом, пещеры Пинеги нельзя считать экстремально олиготрофными ландшафтами. Неглубокое залегание, сопровождающееся инфильтрацией, и ежегодное промывание паводками, говорит о том, что в пещеру постоянно попадают не только растворенные органические вещества, но целые фрагменты почвенных подстилок, а водотоки и паводки приносят живые организмы. То есть даже намытые паводковые глины содержат растворенную органику достаточную для поддержания микробных сообществ, сходных с сообществами минеральных горизонтов некоторых почв на поверхности. Что касается постоянного приноса высших организмов, то: в сифоне, соединяющем пещеры Китеж (Г-140) и Голубинский провал в зимнее время мы обнаруживали бокоплавов, характерных для большинства озер Беломорско-Кулойского плато, а в ручье пещеры Голубинский провал, опять же в зимнее время, были пойманы две лягушки.
Следующий фактор - гипсовая минерализация растворов. Было бы логично предположить, что она в первую очередь должна влиять на бактерий, так как клеточная мембрана при отсутствии ригидной клеточной стенки должна наиболее чувствительно реагировать на изменение осмотического давления. Однако, специальные эксперименты по выращиванию штаммов бактерий на среде с концентрацией сульфата близкой к предельному насыщению продемонстрировали, что гипс не оказывает существенного влияния на большинство компонентов микробного комплекса. Несколько снижается доля миксобактерий и скользящих бактерий, за счет которых увеличивается доля корне-подобных бактерий и актиномицет. При этом кардинальной перестройки сообщества не наблюдается. Позволим себе сделать предположение, что гипс ингибирует бактерий, образующих внеклеточную слизь, таких как миксобактерии и цитофаги.
Еще один возможный фактор, который, к сожалению, пока не поддается нашей оценке, - цикличность природных событий. Речь идет о многообразии циклов, происходящих на поверхности, таких как суточные, сезонные и годовые изменения. Безусловно, косвенным образом это отражается и на пещерах. Например, ежегодный весенний паводок играет роль "листопада" в пещерах, принося новые порции органического вещества, а зимой температура снижается на несколько градусов из-за того, что теплый воздух поднимается вверх, а холодный заходит через нижние входы. Однако, весьма вероятно, что непременным атрибутом функционирования наземных сообществ является ежегодное зимнее промерзание, во время которого реализуются фазы инициации следующего цикла живых организмов. Кроме того, не совсем ясно влияние проникающей солнечной радиации. Есть мнение, что это именно тот фактор, который влияет на синхронизацию многих далеких друг от друга биологических процессов. Очевидно, что в пещерах влияние солнечной активности сказывается в меньшей степени и преимущественно косвенным путем.
И, наконец, фактор, который мы признаем наиболее важным с точки зрения экологии пещерных местообитаний в районе Пинеги, - это температура. Все, без исключения, полученные нами данные говорят о том, что температура - лимитирующий фактор для биологических процессов в пещерах. Рассмотрим это на нескольких характерных примерах.
Пример первый - сульфатредуцирующие бактерии. Эти бактерии весьма распространены во всех озерах и болотах с гипсовой минерализацией. Доминирующим видом для Пинежского района мы считаем вид - Desulfotomaculum acetooxidans, выделенный из черных илов озера Ераськино и болот в районе пещеры Г-1. С того момента, как мы начали изучение пещерной микрофлоры, нам было не совсем понятно, почему в пещерных водоемах, где есть избыток сульфата и достаточное количество растворенной органики, необходимой для жизнедеятельности этих бактерий, бактериальной сульфатредукции не наблюдается. Однако посещение пещеры Пехоровский Провал в 1996 и 1997 годах позволило разрешить эту загадку. Следует отметить, что микроклимат ряда пещер Пинеги зависит от количества поступающей в них воды. По словам Е.В.Шавриной пещеры Пинеги - с "водяным отоплением". То есть во влажный год, когда под землю поступает большое количество теплой воды с поверхности, температура под землей на несколько градусов выше, чем в сухой год. Именно такую картину мы и наблюдали в пещере Пехоровский провал. Во влажном 1996 году температура воздуха в пещере колебалась между 7 и 10 0 С, а температура воды была около 12 0 С. Когда в июле мы спустились в пещеру, и прошли вдоль магистрального ручья, то почувствовали явственный запах сероводорода. Раскопав в нескольких местах глину на дне ручья, мы обнаружили характерные черные илы. Когда же мы посетили пещеру в более сухой 1997 год, то ни малейших следов сульфатредукции не обнаружили. При этом температура воздуха в пещере оказалось в районе 5-6 0 С, а температура воды 6-7 0 С. Впоследствии мы наблюдали за началом процессов сульфатредукции в начале мая в болоте на поверхности, и пришли к выводу о существовании лимитирующей температуры, ниже которой бактерии не развиваются. По "болотным" наблюдениям, она оказалась в районе 70 С, но, по-видимому, эти данные несколько занижены.