Реферат: Біохімічні механізми впливу свинцю на клітини крові щурів
3. Вивчити вплив Pb2+ на показники процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) та стан антиоксидантної системи в еритроцитах і лімфоцитах визначенням концентрацій продуктів ПОЛ та супероксиддисмутазної, глутатіонпероксидазної і глутатіонредуктазної активності в клітинах;
4. З’ясувати можливості корекції метаболічних порушень у процесах ПОЛ та функціональній активності антиоксидантної системи в клітинах крові введенням вітаміну Е (α-токоферолу ацетат).
Об’єкт дослідження: процеси гемопоезу, функціональна активність еритроцитів і лімфоцитів в організмі тварин за умов інтоксикації Pb2+ і корекція метаболічних порушень вітаміном Е.
Предмет дослідження: показники інтенсивності еритро- і лімфопоезу, активність ферментів енергетичного метаболізму, ПОЛ та стан антиоксидантної системи в еритроцитах і лімфоцитах білих щурів.
Методи дослідженя: Для досягнення поставленої мети використовували методи клінічної гематології (підрахунок еритроцитів та лейкоцитів, визначення гематокриту, концентрації гемоглобіну), препаративної біохімії (одержання еритроцитів і лімфоцитів з гепаринізованої крові), цитологічні (кількість клітин крові), морфологічні (визначення відносного вмісту популяцій гранулоцитів і лімфоцитів), спектрофотометрії (вимірювання спорідненості гемоглобіну до кисню, визначення концентрації лактату, дифосфогліцерату, гідропероксидів ліпідів, малонового діальдегіду, вмісту загального білка, визначення активності ферментів енергетичного обміну та ферментів антиоксидантної системи), статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботі впершепроаналізовано біохімічні ефекти свинцю в двох різних за морфологічною будовою і функціями типах клітин – еритроцитах і лімфоцитах за умов парентерального введення щурам ацетату свинцю дозою 10 мг/кг маси. Вони полягають у пригніченні активності піруваткінази, лактатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази у лімфоцитах, а також пригніченні в еритроцитах та лімфоцитах крові активності ферментів антиоксидантної системи (супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази і глутатіонредуктази). З’ясовано особливості метаболічної відповіді цих клітин на одноразове надходження високої дози свинцю. Виявлено порушення процесів еритропоезу та лімфопоезу. Зокрема, зменшення відносного вмісту молодих еритроцитів, збільшенні кількості старих еритроцитів, зниження концентрації гемоглобіну та збільшення паличкоядерних нейтрофільних гранулоцитів. Показано, що процеси ПОЛ – найбільш чутлива до дії свинцю (за умов його одноразового парентерального введення) ланка метаболізму як в еритроцитах, так і в лімфоцитах тварин. Визначено можливість корекції вітаміном Е порушень у процесах ПОЛ та активності антиоксидантної системи в клітинах крові (еритроцити, лімфоцити), спричинених гострою інтоксикацією катіонами свинцю.
Практичне значення одержаних результатів. Установлені ефекти можуть бути використані під час розробки тест-систем для виявлення станів інтоксикації організму сполуками свинцю та створення схем корекції порушень у клітинному метаболізмі, зумовлених катіонами важкого металу, а також у курсах лекцій з біохімії та фізіології людини і тварин.
Особистий внесок здобувача. Відповідно до мети і завдань дисертаційної роботи автор особисто виконала експериментальні дослідження, статистично опрацювала результати, проаналізувала наукову літературу за темою дисертації, сформулювала основні висновки роботи. Аналіз одержаних результатів та підготовку до друку публікацій за матеріалами дисертації здійснено разом з науковим керівником, доктором біологічних наук професором З.Д. Воробцем. Ряд розділів роботи обговорено з доктором біологічних наук, професором Г.Л. Антоняк. Окремі експериментальні дослідження виконано за участю співавторів публікацій.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на науково-практичній конференції “Досягнення молодих вчених у вирішенні проблем тваринництва та ветеринарної медицини” (Львів, 2004 р.), на ювілейній 67-й підсумковій науковій конференції СНТ ім. М.Д.Довгялло, присвяченій 75-річчю ДонДМУ ім. М.Горького (Донецьк, 2005 р.), 48-й підсумковій науково-практичній конференції “Здобутки клінічної та експериментальної медицини” Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського (Тернопіль, 2005р.), 9-муУкраїнському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 р.), Міжнародній науковій конференції ”Механізми функціонування фізіологічних систем” (Львів, 2006 р.).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 10 наукових публікаціях (з них 5 статей опубліковано в наукових фахових виданнях та 5 тез доповідей – у матеріалах конференцій).
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень та їх аналізу, висновків і списку використаних джерел із 337 найменувань. Робота викладена на 136 сторінках, містить 17 таблиць і 9 рисунків, які складають 14 сторінок.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Висвітлено шляхи надходження, транспорту, нагромадження, перерозподілу та виведення сполук свинцю з організму тварин. Показано вплив даного важкого металу на функціонування органів і систем організму, механізми впливу на деякі процеси метаболізму (антиоксидантну систему, перебіг процесів пероксидного окиснення ліпідів, еритро- і лімфопоезу).
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили на 120 безпородних білих щурах масою 150–180 г, яких утримували в умовах віварію.
Ацетат свинцю вводили тваринам одноразовою внутрішньочеревинною ін’єкцією у дозі 10 мг Pb/кг маси тварин. При виборі дози користувались даними літератури (HaradaK., MiuraH., 1983; ItoY.etal. 1985; VargasН. etal., 2003).
Вітамін Е (α-токоферолу ацетат) дозою 300 мг/кг маси вводили тваринам перорально щодоби впродовж трьох діб після введення ацетату свинцю. Для досліджень використовували тварин на 3-тю і 10-ту доби експерименту.
Матеріалом досліджень була змішана периферична кров, яку отримували після декапітації тварин дослідних і контрольної груп.
Кількість клітин крові (еритроцити і лейкоцити) досліджували за допомогою підрахунку в камері Горяєва, відносний вміст паличкоядерних і поліморфоядерних нейтрофільних гранулоцитів і лімфоцитів визначали цитологічними дослідженнями мазків крові (Неменова Ю.М., 1976). Відносний вміст популяцій еритроцитів крові (молоді, зрілі й старі клітини) визначали фракціонуванням у градієнті густини сахарози (Сизова И.А.и др., 1985).
Для отримання еритроцитів гепаринізовану кров центрифугували на рефрижераторній центрифузі. Плазму відбирали, а клітини тричі промивали фізіологічним розчином(0,85%NaCl)з подальшим центрифугуванням (Неменова Ю.М., 1976).Лімфоцити з гепаринізованої крові виділяли методом диференціального центрифугування в градієнті густини фіколу і верографіну (Boyum А.А., 1968; Mishell В.В., ShiigiS.M., 1980).
Концентрацію гемоглобіну в гемолізатах визначали вціанметформі при 540нм за методом Драбкіна (DrabkinD.,AustinH., 1935). Спорідненість гемоглобіну до кисню визначали спектрофотометричним методом побудови кривих кисневої рівноваги гемоглобіну, який ґрунтується на відмінностях у спектрах поглинання оксигенованого і деоксигенованого гемоглобіну (Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И., 1987; Столяр О.Б. та ін., 1984).
Концентрацію лактату визначали в позбавленому білків екстракті клітин за допомогою ферментного методу (ChapmanR.G.etal., 1962), аналізували загальну концентрацію 2,3-дифосфогліцерату (2,3-DPG) в еритроцитах методом (DyceB.J., BessmanS., 1973).
У лізатах клітин (еритроцити, лімфоцити) визначали активність ферментів енергетичного обміну: піруваткінази (BergmeyerH.U., BerntE., 1974), лактатдегідрогенази (ChapmanR.G.etal., 1962), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (DeutschJ., 1983). Крім цього, в лізатах лімфоцитів визначали NADP-залежну ізоцитратдегідрогеназну активність (GoldbergD.M., EllisG., 1983). Активність ферментів визначали за допомогою спектрофотометричних методів, що ґрунтуються на використанні систем окиснення й відновлення нікотинамідних коферментів (BergmeyerH.U., GrasslM., 1983). Вміст білка в лізатах визначали методом Лоурі (LowryO.H. etal., 1951).
У лізатах клітин визначали активнiсть ферментів антиоксидантної системи: супероксиддисмутази (Дубинина Е.Е. и др., 1983), глутатіонпероксидази (Моин В.М., 1986) і глутатіонредуктази (BergmeyerH.U., Grassl М., 1983), а також концентрацію продуктів пероксидного окиснення ліпідів: малонового діальдегіду (Коробейникова Е.Н., 1989) і гідропероксидів ліпідів (Орехович В.Н., 1977).
Статистичну обробкурезультатів здійснювали в режимі програмного забезпечення на персональному комп’ютері ІВМ РСіз використаннямкритерію Стьюдента (Кокунин В.А, 1975).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
??? ??????????? ??????? ???????? Pb2+ ?? ?????? ????????? ?????????? ????? ??????? ?????? ?? ???? ???? ???????????? ??????????????? ???????? ????? 10 ??/?? ???? ?? ?????????? ????? ?????? ????? (??????????, ?????????), ????????? ????? ?? ?????????, ???????????? ????? ?? ???? ????????? ???????? ???????? ????????????? ? ????? ???????????? ????? (????????? ?.?. ? ??., 1969; StankiewychW., 1973; ?????????? ?.?., ???????? ?.?., 1984; ??????? ?.?., ??????? ?.?., 1997).Вплив іонів свинцю на динаміку еритроцитів у периферичній крові щурів
Введення ацетату свинцю експериментальним тваринам зумовлює істотні зміни показників стану кровотворення, які виявляються і щодо еритропоезу, і щодо лейкопоезу. З’ясовано, що впродовж 10 діб експерименту в крові щурів зменшується загальна кількість еритроцитів, показник гематокриту (p <0,05 ), але об’єм еритроцитів у цей період досліджень залишається стабільним.
Як відомо, склад еритроїдних клітин у крові тварин неоднорідний, у кровообігу одночасно функціонують молоді, зрілі й старі еритроцити, які відрізняються функціональними характеристиками (Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И., 1987; ShermanI.W. etal., 2004). Результати досліджень динаміки популяцій еритроцитів у крові щурів, яким вводили ацетат свинцю, свідчать, що характерним є зменшення вмісту фракції молодих клітин у крові тварин 3-ї дослідної групи, аналізованих на 10-ту добу після введення токсиканта (p <0,05 ).