Реферат: Биологическая характеристика возбудителей вирусных трансфузионных гепатитов

Целью настоящей работы было ознакомление с данными отечественных и зарубежных авторов о биологических свойствах, механизмах патогенеза вирусов – возбудителей парентеральных гепатитов.

1. Обзор литературы

1.1 Историческая справка

С. П. Боткин в 1888 г. впервые высказал предположение об инфекционной природе «катаральной желтухи» человека. Вирусная природа болезни была доказана в 1937 г. в США Дж. Финделем и Ф. Мак Коллюмом. Это открытие подтвердили П. Г. Сергеев и Е. Тареев, в 1940 г. при изучении желтух у привитых против лихорадки Паппатачи. В 1965 г. В. Блюмберг выделил так называемый «австралийский антиген», оказавшийся поверхностным антигеном вируса гепатита В (HBsAq ), а в 1970 г. – Д. Дейн выявил вирус гепатита В в крови и клетках печени. В 1973 г. С Фейнстоуну в фекалиях больного удалось идентифицировать возбудитель гепатита А. В 1977 г. М. Ризетто открыл вирус – паразит D (дельта – вирус), вызывающий дельта инфекцию только при наличии у больного HBsAq .

В конце 80-х годов группе американских специалистов удалось выделить и идентифицировать геном вируса С и в 1989 г. разработать тест-систему ИФА. На вирус гепатита Е первым в 1980 г. обратил внимание М. Гуро, а в 1982 г. С. С. Балаян, обладавший напряженным иммунитетом к ВГА заразил себя материалом, полученным от девяти больных повторно заболевших вирусным гепатитом (первый гепатит у них был связан с ВГА), и заболел. Так, экспериментально было доказано существование этиологически самостоятельного возбудителя, который окончательно был идентифицирован в 1987 г. Вирус гепатита G был выделен в 1995 г. научной группой фирмы “Abbot” от больного хроническим гепатитом С . Последним вирусом, получившим научную классификацию на сегодняшний день, является возбудитель гепатита ТТ , который в 1997 г. обнаружили японские исследователи [10].

Вирус гепатита F сейчас является предметом дискуссий и споров между учеными.

1.2 Вирус гепатита В.

HBV распространен по всему миру. Является самым распространенным началом хронических заболеваний печени, в том числе гепатоцеллюмерной карциномы у человека[ 4 ].

Открытию HBV предшествовало выявление в 1965 году в крови австралийского аборигена так называемого австралийского антигена, представляющего собой поверхностные капсидные белки вируса гепатита В человека. Позднейшими исследованиями были установлены аналогичные вирусы и у животных (сурков, земляных и лесных белок, кенгуру, цапель, пекинских уток, гремучих змей). HBV в последние годы отнесен к семейству – Hepadnaviridae [ 6 ].

1.2.1 Формы HBV, встречающиеся в крови .

Поверхностный антиген HBV (HBsAg ) был открыт в 1963 году при исследовании полиморфизма сывороточных белков человека [ 10,15 ].

Первыми корпускулярными формами HBsAg , которые установила электронная микроскопия были небольшие сферические частицы, диаметром от 16 до 25 нм, названные в дальнейшем (22 нм) частицами, а также нитевидные и палочкообразные частицы, имеющие 22 нм в ширину и несколько сотен нанометров в длину. Они состоят из белка, углеводов и липидов, не содержат ДНК и сейчас рассматриваются как неполная форма оболочечного белка вируса [1 ].

В 1970 году Дейн описал большую более сложную частицу, содержащую HBsAg . Она представляет собой полный вирион HBV , диаметром 42 нм, имеет липидосодержащий наружный слой (оболочку) толщиной 7 нм и электроноплотную сферическую внутреннюю сердцевину (нуклеокапсид) диаметром 28 нм. Поверхность вириона имеет антигенные детерминанты HBsAg , общие с неполными формами вируса. Наружная оболочка удаляется обработкой неионными детергенами, такими как NP-40, после чего остаются сердцевинные частицы, содержащие HB с Ag , химически отличающиеся от HBsAg . Сердцевина вируса содержит также вирусную ДНК с ковалентно присоединенным полипептидом, протеинкиназу и третий антиген, ассоциированный с инфекционностью HBV – (HBeAg ), присутствующий в скрытой форме [5,15].

Введение шимпанзе 1 мл некоторых неразведенных HBsAg реактивных сывороток, полученных от больных с хроническими HBV , после антивирусной терапии, не вызвало у них инфекции. Вывод: у таких больных HBsAg циркулирует только в составе неполных частиц, но не в составе полных вирионов. Однако, сыворотки некоторых больных были заразны в разведениях 10^-7 [ 2,12 ].

1.2.2 Структура HBsAg .

Это сложный антигенный комплекс. В этих частицах может определятся пять антигенных детерминант.

Группоспецифическая детерминанта а – общая для всех препаратов HBsAg. Еще есть две пары подтиповых детерминант: d или y , или w, или r – взаимоисключающие друг друга. Описаны антигенная гетерогенность w – детерминант и добавочные детерминанты, такие как q или x или g [15,7]. Идентифицировано 8 подтипов HBsAg : ayw₁ , ayw ₂ , ayw ₃ , ayw ₄ , ayr , adw ₂ , adw ₄ , adr [11]. Необычные комбинации подтипов детерминант выделяются на Дальнем Востоке. Наблюдается неравномерное географическое распределение подтипов HBsAg среди зараженного населения. В Северной Америке, Европе и Африке преобладают подтипы adw и ayw, а в Юго – Восточной Азии и на Дальнем Востоке – подтип adr на ряду с adw и ayw . Подтип ayr менее распространен в мире, но он идентифицирован у нескольких изолированных групп населения Океании [15,3].

Доказано, что вирус – специфическим антигеном является HBsAg , иммунизация которым обеспечивает защиту от HBV .

Для определения х/с HBsAg сферические нитевидные частицы можно очистить гельфильтарцией, скоростным зональным центрифугированием в градиенте плотности CsCl. При центрифугировании в градиенте плотности CsCl эти частицы отделяются от вируса благодаря различиям в их плавучих плотностях. Плавучая плотность (22 нм) – сферических частиц подтипов adw и ayw равна 1,20 г/см³ в CsCl и 1,17 г/см³ в сахарозе. Это свидетельствует о значительном содержании в них липидов приблизительно 30%. Более высокая плавучая плотность полных вирионов приблизительно 1,28 г/см³ для вирионов с нуклеокапсидом, содержащем ДНК и 1,24 г/см³ для вирионов с пустой сердцевиной, отражает вклад нуклеиновой кислоты в нуклеокапсиды. Липидный анализ дает смесь липидов[5,7,3,15].

Средняя молекулярная масса HBsAg / adw равна 3,7*10⁶ - 4,6*10⁶ . при изоэлектрическом фокусировании препаратов (22 нм) – частиц HBsAg выявляется несколько популяций с различными значениями pI от 3,65 до 5,3. Средний коэффициент сидиментации для HBsAg варьирует от 39 S до 54 S. Определение среднего удельного коэффициента экстинкции 1% р-ра очищенного белка HBsAg при 280 нм лежит в пределах от 37,3 до 60,0 [13].

Методом электорофореза в ДСН – ПААГ в очищенных препаратах (22 нм) – частиц HBsAg adw - , ayw – и adr – подтипов выделено 7 или более полипептидов с молекулярной массой от 25000 до 100000. В связи с тем, что наружная оболочка вирионов HBV содержит HBsAg и липиды (частично взятые у клетки хозяина), предположили, что она химически похожа на 22 нм частицу HBsAg [5,7,15].

1.2.3 Структура вирусных нуклеокапсидов.

Сердцевина вириона несет сердцевинный антиген HBV (HBcAg ), который обнаружен в крови, как внутренний компонент вириона. Он иногда определяется в сыворотке в ранний период виремии до появления антител к HB с Ag . Исследования показали, что значительная фракция HB с Ag – частиц, выделенных из вирионов и меньшая фракция их выделенная из зараженной печени, имеет высокую плавучую плотность в CsCl (1,38 г/см³ ) и содержит ДНК и ДНК - полимеразную активность [1,13,15]. Установлено, что высокоочищенные сердцевины, полученные из вирионов и HB с Ag – частицы, выделенные из печени, содержат несколько уникальных полипептидов от 19 к до 38 к. Полипептид 19 к может реагировать с антителами е – антигену HBV (анти - HBe ) [14,15].

1.2.3.1 Природа HBeAg

Идентифицирован в 1972 году; физически и антигенно отличается от HBsAg и HB с Ag , трудно поддается очистке, представляет собой комплекс антигенов. В огаровом геле дается до 3 линий преципитации: е₁ , е₂ , е₃ . в сыворотках больных HBV определяются как связывающийся с (IgG) HB с Ag с молекулярной массой 300 к, так и меньший «свободный» HBeAg с молекулярной массой 30 – 35 к. Свободная форма способна к диссоциации на меньшие полипептиды с молекулярной массой 15,5 к. Особо следует отметить, выраженную корреляцию присутствия HBeAg в сыворотке больных с высокой концентрацией физических вирусных частиц. Есть данные, что HBeAg и вирионы продуцируются вместе во время инфекции, кроме этого известно, что HBeAg является компонентом вириона, из которой активно высвобождается при разрушении ее детергентом [5,15].

Информация об HBeAg заложена в С – гене. Многочисленные факты, полученные при изучении HBV позволили сделать вывод о связи HBeAg с инфекционностью и наличием вируса. Оказалось, что инфекционность сывороток крови с HBeAg в миллион раз выше, чем с анти – Hbe . Однако, эта связь не абсолютна. Выявлены мутантные формы HBV , при которых блокируется синтез HBeAg . При этом, не смотря на наличие анти – Hbe в сыворотке крови удается тестировать ДНК – HBV . Исследования последних лет, связанные с изучением мутантных форм HBV , позволили по-новому взглянуть на значение HBeAg в патогенезе HBV . Предполагают, что у матерей носителей HBV HBeAg , проходя через плаценту, вызывает развитие иммунной толерантности, приводящей к прогрессированию в хронический гепатит [7,15].

1.2.3.2 Роль HBxAg

Считают, что х – антиген является как регуляторным белком, усиливающим синтез вирусных белков, так и возможно, белком, включенным в структуру HBV . HBxAg играет особую роль в развитии первичной гепатоклеточной карциномы. Р – ген, ДНК – полимеразы - фермент, информация о котором заложена в ДНК HBV. Он обладает ферментативной активностью как РНК – зависимая ДНК – полимераза и необходим для достройки внутренней короткой цепи ДНК HBV в процессе ее репликации [13,15].

1.2.4 Физическая и генетическая структура вирусной ДНК.

Вирионы HBV имеют маленькую кольцевую, частично двухцепочечную молекулу ДНК. Одноцепочечные участки варьируют по длине, составляя в различных молекулах от ~ 15 до 60%. Таким образом, ДНК состоит из длинной цепи L постоянной длины (~ 3220 оснований) во всех молекулах и короткой (S ), которая в различных молекулах варьирует по длине от 1700 до 2800 оснований. ДНК полимеразы достраивает одноцепочечные участки вирусной ДНК до полностью двухцепочечной молекулы, содержащей приблизительно 3200 bр. Синтез ДНК начинается на 3' конце короткой цепи, которая в разных молекулах находится на различных участках в пределах специфической области ДНК и заканчивается по достижении 5' конца короткой цепи, расположенного в строго определенной месте. Длинная цепь не является замкнутой окружностью: в точке, расположенной приблизительно на расстоянии 300 bp от 5' конца короткой цепи, существует разрыв. С помощью нагревания при определенных условиях, которая вызывает избирательную денатурацию 300 – нуклеотидной области между 5' концом короткой цепи и разрывом длинной цепи, кольцевая ДНК может быть превращена в линейную форму с одноцепочечными липкими концами. Линейная форма может быть вновь переведена в кольцевую путем реассоциации комплементарных одноцепочечных концов. По видимому, 5' концы обеих, как длиной, так и короткой цепей ДНК HBV блокированы таким образом, что предотвращено их фосфорилирование полинуклеотиназой. Химическая природа цепи ДНК, выделенной из вирионов ковалентно присоединена к полипептиду, что предотвращает ее фосфорилирование [7,15].

1.2.5 Механизм репликации вирусов .

После проникновения вируса в клетки печени в клеточных ядрах формируются замкнутые кольцевые вирусные ДНК, состоящие из 3200 bp. Они могут функционировать как матрицы для синтеза вирусной мРНК и синтеза плюс РНК полной длины, новосинтезированная вирусная ДНК – полимераза и белок – затравка для синтеза минус – цепи ДНК собираются в комплекс с мажорным структурным полипептидом в сердцевины вируса и образуют сердцевину или нуклеокапсид вируса. Затем внутри нуклеокапсида синтезируется минус – цепь вирусной ДНК. В этом процессе используется белковая затравка и РНК матрица, которая по мере синтеза ДНК деградирует под действием РНК азы Н. на матрице минус – цепи ДНК кольцевой конформации синтезируется плюс – цепь вирусной ДНК. Затем частицы сердцевины собираются в полные вирионы с HBcAg и липидосодержащими оболочками клеточной мембраны. В случае HBV формирование вируса и выделение его из клетки могут, происходить, очевидно, на любой ступени после сборки сердцевины, так как вирионы (частицы Дейна) содержащие молекулы гибридов ДНК – РНК, а также частично одноцепочечные кольцевые ДНК обнаруживаются в крови. Эндогенное ДНК полимеразы в вирионах катализируют включение нуклеотидов в минус – цепи ДНК гибридов РНК – ДНК и в плюс - цепи ДНК частично одноцепочечных молекул [15].

1.2.6 Чувствительность HBV к физико – химическим факторам.

Характеризуется значительной устойчивостью, при t = -20С^о сохраняется до 20 лет, не инактивируется при замораживании – оттаивании, сохраняется при 56 С^о около суток, а при 60 С^о – 30 минут. Антиген устойчив к воздействию протеолитических ферментов и органических растворителей. Под действием эфира, хлороформа, 1,5% формалина, 2% р-ра фенола не инактивируется несколько часов. При t = 100 С^о надо несколько минут, чтобы убить вирус. В сыворотке сохраняется 6 месяцев при 30 – 32 С^о . после высушивания вирус сохраняет жизнеспособность при 25 С^о около недели. При процедуре фракционирования плазмы по Кону, большая часть HBV , HBeAg , ДНК – полимеразы сохраняется в первой фракции (фибриноген, фактор - восемь) или во фракции три (протромбиновый комплекс), тогда как большая часть HBsAg перемещается во фракцию четыре (плазматических белков), а меньшее количество во фракции три и пять (альбумин). После прогревания HBV до 60С^о в течении 4 часов вирус не инактивируется, 10 часов при 60 С^о ликвидирует его. При 98 С^о инфекционность сыворотки частично устраняется через 1 минуту или полностью через 20 минут. Сухой жар 160 С^о разрушает инфекционность через час. В другой серии опытов HBV в течении 10 минут обрабатывали при 20 С^о одним из пяти дезинфицирующих препаратов (гепатохлоридом натрия + 500 мг свободного активного хлора на 1 литр; Cidex СХ – 250 + 2% водный р-р глутаральдегида, рН – 8,4; Sporicidin рН – 7,9 + 0,12% - ный глутаральдегид и 0,44% - ный фенол; 70% - ным изопропиловым спиртом; Weskodine, разведенным 1:213 и содержащим 80 мг активного йода на 1 литр) и затем вводили одному шимпанзе. Ни у одного из пяти не было отмечено признаков заболевания. На конец отмечено, что обработка вета – пропилактоном + УФ – лучами уменьшает титр HBV в плазме приблизительно в 10 млн. раз [14,15].

1.3 Вирус гепатита D

Впервые обнаружил Ризетто в 1977 году в гепатоцитах во время вспышки сывороточного гепатита в Южной Европе. Позднее стали выявлять повсеместно.

Возбудителем заболевания является дефектный вирус с размерами вириона 35 – 37 нм. Систематизирован в состав Deltavirus семейства Togaviridae . Внутренний компонент частицы состоит из РНК с относительной молекулярной массой 500.000. прослеживается четкая связь между HBV и DAg . DAg является саттелитом HBV ; HBsAg которого всегда является внешней оболочкой вируса гепатита D. Таким образом, полноценный вирус D состоит из РНК, внутреннего антигена (YDAg ) – собственно вируса гепатита В и его внешней оболочки, состоящей из HBsAg . Геном гепатита D кодирует лишь один известный продукт – фосфопротеин, обладающий антигенными свойствами [2].

Вирус гепатита D термоустойчив, УФ – облучение инфекционную активность не уменьшает. Надежно убивается при автоклавировании в режимах, аналогичных для HBV . Погибает при кипячении не раньше, чем через 5 минут [14].

1.3.1 Пути передачи HDV

Передается D -инфекция парентерально, с зараженной кровью. Часто она встречается у больных с гемофилией, у лиц, имеющих контакт с кровью. Резервуаром HDV является инфицированный человек. Заражающая доза для D -гепатита существенно меньше, чем у HBV и составляет всего 10^-11 мл вируссодержащей крови. Вирус HDV по содержанию в биологических жидкостях уступает HBV , но все они считаются потенциально опасными. Возможно также передача H D V при половых контактах (гетеросексуальные ~ 50%, гомосексуальные более 90%). Есть возможность передачи HDV от матери к ребенку, большая при родах, меньшая – при кормлении грудью [10].

Среди животных резервуар пока не обнаружен. Распространение HDV коррелирует с уровнем выявления HBsAg . Среди носителей HBV около 5% (от 0,1% до 20 – 30%), населения инфицировано HDV . Наибольшая зараженность в странах экваториального и тропического климата. Эндемичной зоной HDV является Италия и страны Ближнего Востока. По данным С. О. Вязова этот гепатит широко распространен и в СНГ и чаще выявляется при тяжелых хронических заболеваниях печени [10,14].

1.4 Вирус гепатита С

Обнаружен у людей, заболевших гепатитом после переливания крови или ее препаратов, где отсутствовали маркеры HBV . Это дало основания утверждать, что существует еще один или несколько возбудителей вирусных гепатитов с парентеральным механизмом передачи [3].