Реферат: Інсулін
Проте практичне виділення інсуліну належить групі вчених Торонтського університету. У жовтні 1920 року Фредерик Бантінг прочитав в роботах Мінковського про те, що якщо у собак перешкоджати виділенню травного соку з підшлункової залози, то залізисті клітки незабаром гинуть, а острівці залишаються живими, і цукровий діабет у тварин не розвивається. Цей цікавий факт примусив його задуматися над можливістю виділення із залози невідомого чинника, сприяючого зниженню рівня цукру в крові. З його записок: «Перев'язати собаці панкреатичну протоку. Залишити собаку, поки не руйнуватимуться ацинуси і залишаться тільки острівці. Спробувати виділити внутрішній секрет і подіяти на глікозурію»
У Торонто Бантінг зустрівся з Дж. Маклаудом (J. Macleod) і виклав йому свої міркування в надії заручитися його підтримкою і отримати необхідне для роботи устаткування. Ідея Бантінга спершу здалася професорові абсурдною і навіть смішною. Але молодому ученому таки вдалося переконати Маклауда підтримати проект. І літом 1921 року він надав Бантінгу університетську лабораторію і асистента, 22-річного Чарльза Беста, а також виділив йому 10 собак. Їх метод полягав в тому, що навколо вивідної протоки підшлункової залози затягувалася лігатура, перешкоджаючи виділенню із залози панкреатичного соку, і опісля декілька тижнів, коли зовнішнєсекреторні клітини загинули, в живих залишалися тисячі острівців, з яких їм вдалося виділити білок, який достовірно знижував рівень цукру в крові у собак з видаленою підшлунковою залозою. Спершу його назвали «айлетін».
Після повернення з Європи, Маклауд оцінив значення всії виконанної його підлеглим роботи, проте для того, щоб бути повністю упевненим в ефективності методу, професор зажадав ще раз переробити експеримент при собі. І опісля декілька тижнів, було ясно, що друга спроба також успішна. Проте виділення і очищення «айлетіну» з підшлункових залоз собак було надзвичайно трудомісткою і тривалою роботою. Бантінг вирішив спробувати використовувати як джерело підшлункові залози ембріони телят, в яких ще не виробляються травні ферменти, але вже синтезується достатня кількість інсуліну. Це істотно полегшило роботу. Після рішення проблеми з джерелом інсуліну, наступним важливим завданням стало очищення білку. Для її вирішення в грудні 1921 року Маклауд привернув блискучого біохіміка, Джеймса Колліпа, який у результаті зумів розробити ефективний метод очищення інсуліну.
11 січня 1922 року, після безлічі успішних випробувань з собаками, страждаючому діабетом 14-річному Леонарду Томпсону була зроблена перша в історії ін'єкція інсуліну. Проте перший досвід застосування інсуліну виявився невдалим. Екстракт опинився недостатньо очищеним, і це привело до розвитку алергії, тому ін'єкції інсуліну були припинені. Наступні 12 днів Колліп напружено працював в лабораторії над поліпшенням екстракту. А 23 січня Леонарду була введена друга доза інсуліну. Цього разу, успіх був повним, не тільки не було явних побічних дій, але і у хворого перестав прогресувати діабет. Проте надалі Бантінг і Бест не спрацьовували з Колліпом і незабаром з ним розлучилися.
Було потрібно навчитися отримувати великі кількості чистого інсуліну. І перш ніж був знайдений ефективний спосіб швидкого промислового отримання інсуліну, була проведена дуже велика робота. Важливу роль в цьому зіграло знайомство Бантінга з Елі Ліллі, майбутнім засновником найбільшої фармакологічної компанії.
За це революційне відкриття Маклауд і Бантінг в 1923 році були удостоєні Нобелевскої премії з фізіології і медицини. Бантінг спершу був сильно обурений, що його помічник Бест не був представлений до нагороди разом з ним, і спочатку навіть демонстративно відмовився від грошей, але потім все ж таки погодився прийняти премію, і свою частину урочисто розділив з Бестом. Також поступив і Маклауд, поділивши свою премію з Колліпом. А патент на інсулін був проданий Торонтскому університету за один долар, і незабаром почалося виробництво інсуліну в промислових масштабах.
Заслуга за визначення точної послідовності амінокислот, створюючих молекулу інсуліну (так звана первинна структура) належить британському молекулярному біологові Фредеріку Сенгеру. Інсулін став першим білком, для якого була повністю визначена первинна структура. За виконану роботу в 1958 році він був удостоєний Нобелівської премії з хімії. А через майже 40 років Дороті Кроуфут Ходжкин за допомогою методу рентгенівської дифракції визначила просторову будову (третинну структуру) молекули інсуліну. Її роботи також відмічені Нобелівською премією.
Будова молекули інсуліну
Відносна молекулярна маса мономера інсуліну складає близько 6000.
Молекула інсуліну утворена двома поліпептіднимі ланцюжками, що містять 51 амінокислотний залишок: ланцюг з N-кінцевим гліцином називається A-ланцюжок, складається з 21 амінокислотного залишку, B-ланцюжок утворений 30 амінокислотними залишками. Поліпептідні ланцюжки з'єднуються двома дисульфідними містками через залишки цистєїну, третій дисульфідний зв'язок розташований в A-ланцюжку.
Цілісність дисульфідного зв’язку грає велику роль у збереженні біологічної активності молекули інсуліну.
Первинна структура інсуліну у різних біологічних видів трохи відрізняється, як відрізняється і його важливість в регуляції обміну вуглеводів. Найбільш близьким до людського є інсулін свині, який розрізняється всього одним амінокислотним залишком: у 30 положенні B-ланцюжка свинячого інсуліну розташований аланін, а в інсуліні людини — треонін; бичачий інсулін відрізняється трьома амінокислотними залишками; а у риб у порівнянні з тваринним В-ланцюг більше і має 32 амінокислотних залишки.
Близько 25 амінокислот ідентичні у всіх хребетних. У зв’язку з цим імунологічні відмінності інсулінів людини і тварин невеликі, що дає можливість застосовувати в клініці інсуліни тваринного походження (бичий, свинячий).
Проте при тривалому застосуванні препаратів чужерідного походження інсуліну може все ж проявлятись антигенність гормону, в результаті чого у хворих розвивається високий титр антиінсулінових антитіл і ефективність інсуліну різко падає. У таких випадках необхідно застосовувати інсулін іншого походження.
Молекула інсуліну людини
Біосинтез інсуліну, регуляція секреції інсуліну
Інсулін синтезується у базофільних інсулоцитах ( β-клітинах)острівців Лангерганса підшлункової залози із свого попередника – проінсуліну.
Синтез інсуліну відбувається в β-клітках і починається з утворення на рибосомах одноланцюжкового пептиду, що складається з 104—110 амінокислотних залишків, — препроінсуліну. Ця молекула включає А-ланцюг, В-ланцюг і розташований між ними вставний С-пептид. Препроінсулін потрапляє в шорсткий ендоплазматичний ретікулум, по якому пересувається до секреторних гранул. У цистернах шорсткого ендоплазматичного ретікулума відбувається відщеплювання частини молекули і залишається преінсулін, що складається з 81—86 амінокислотних залишків. У комплексі Гольджі відбувається упаковка гормону в секреторні гранули, в яких проінсулін піддається подальшому протеолітичному розщепленню. В результаті відщеплюються С-псптид і два діпептида, сполучаючі С-пептид з фрагментами А і В, а ланцюги А і В з'єднуються дисульфідними містками, утворюючи молекулу двохланцюгового інсуліну. У секреторних гранулах виявляються проінсулін, частково розщеплений проінсулін, інсулін і С-пептид. Всі вони виводяться з β-клітин в кров.
Схема розщеплення проінсуліну.
Кожен кружок показує амінокислотний залишок.
Чорні кружки – С-ланцюг, сірі – А-ланцюг, білі – В-ланцюг, перехрещені – дипептиди, вищепленні в процесі утворення активного гормона.
Поліпептидна основа молекули інсуліну (первинна структура) згорнута спіралеобразно (вторинна структура), а спіралі, у свою чергу, згущуються в складні утворення, що визначають просторову конфігурацію молекули інсуліну або її третинну структуру.
Просторова конфігурація молекули бичого інсуліну
Інсулін і проінсулін легко полімеризуються, утворюючи димери, тримери, гексамери. Полімеризація відбувається шляхом комплексирування з цинком. При цьому утворюються малорозчинні комплекси, і гормон депонується в секреторних гранулах. Гормон, що депонує, — резерв, який може бути швидко реалізований під впливом відповідного стимулу.
Секреторні гранули (тример Zn-інсулін)