Реферат: Микрохирургия
Для получения соматических гибридов при электростимуляции были использованы и другие приемы: создание плотной суспензии с помощью центрифугирования, стимулирование адгезии с помощью различных химических агентов, культивирование клеток в монослое, где естественным образом формируются межклеточные контакты, на электропроводящей подложке.
В некоторых работах было специально проведено сравнение эффективности электрослияния фибробластоподобных клеток при различных способах достижения мембранного контакта:
1) посредством диэлектрофореза клеток в переменном электрическом поле,
2) с помощью центрифугирования и образования плотного клеточного осадка,
3) путем выращивания клеток на проводящей подложке и формирования двойного клеточного слоя. Показано, что наиболее эффективным оказался третий способ (индекс слияния 50-70%) и практически неэффективным - первый. Авторы объясняют это возникновением в условиях естественного формирования двойного клеточного слоя (по данным электронной микроскопии) обширных межклеточных контактов, что повышает вероятность слияния при воздействии поля. Однако использование этого способа возможно только для клеток, способных к росту и формированию контактов, поэтому авторы предполагают, что наиболее универсальным может оказаться второй способ получения мембранных контактов.
Другой важный вопрос состоит в подборе оптимальной межклеточной среды, в которой проводится электрообработка клеток. Так, имеются указания, что присутствие в среде одновалентных ионов в концентрации выше 20 мМ значительно понижает эффективность электрослияния. Однако в одной из работ убедительно показано, что ионная сила раствора не влияет на величину нарушения барьерных свойств мембраны при электрическом пробое, а, по-видимому, изменяет характер контактов между мембранами. В случае наличия хороших контактов между фибробластами, когда они растут на плоской подложке, наблюдается высокий индекс электрослияний при концентрациях Nad или КCl, достигающих 140 мМ.
В работах Сухарева, Бандриной, Барбула отмечается, что электрообработка клеток в среде, содержащей 1-2 мМ Са 24 ", приводит практически к 100% -ной гибели клеток. По-видимому, в этих условиях необратимо нарушается ионный гомеостаз за счет значительного входа ионов кальция в цитоплазму. А при обработке клеток в среде с низким содержанием кальция (10 мкМ) выживаемость клеток резко возрастает (до 40%). Ситуация улучшается еще больше, если после электрообработки клетки помещаются в среду, богатую ионами натрия. В этих работах также указывается, что важным положительным компонентом среды электрообработки является сахароза (100-150 мМ), а также диализованная против бескальциевого буфера сыворотка (в количестве l/s по объему). Это позволяет получить максимальный выход поликарионов, которые жизнеспособны в течение нескольких дней.
В ряде исследований указывается, что цитоскелет, вероятно, не принимает непосредственного участия в процессе слияния клеток после их электрообработки и слияния цитоплазм, характерное время которого для L-клеток ~90-120 мин, так как ни цитохалазин В и Д, николцемид практически не влияют на скорость и конечный индекс слияния. Также указывается, что разбавление среды после электрообработки дистиллированной водой на Уз ускоряет процесс объединения цитоплазм клеток. Предполагается, что это связано с изменением натяжения поверхностной мембраны.
Итак, в настоящее время уже достаточно широко ведутся исследования по поиску оптимальных условий для электрослияния животных клеток.
Метод электростимулируемого слияния клеток начинает широко использоваться и для растительных клеток. Для растительных протопластов Petuniainflata установлено, что полученные электростимулируемым слиянием гибридные клетки способны образовывать клеточные стенки и делиться. Описано электрослияние протопластов из листьев диплоидного вида картофеля с суспензионными протопластами махорки. Разная способность к слиянию протопластов из листьев и суспензии позволила подобрать условия для получения 40-50% гетерологических слияний, 60-70% из которых составляли бинарные (1:
1). Отмечается, что важная модификация метода электрослияния растительных клеток состоит в возможности предварительного отбора пары протопластов, предназначенных для слияния. Это позволяет по-новому подойти к решению трудной проблемы отбора гибридных продуктов при массовом слиянии протопластов. Несомненное преимущество электрослияния - контролируемость процесса, увеличение числа попарно слившихся и, более того, специально выбранных для этого протопластов, привлекает к указанному методу все большее число исследователей.
Таким образом, на разнообразных типах животных и растительных клеток показана эффективность использования для их реконструкции метода электростимулируемого слияния клеток. Не случайно метод получает быстрое распространение в различных лабораториях.
Необходимо отметить, что, как правило, в работах, где используют либо суспензии клеток, либо монослойную культуру, применяют способ множественного слияния клеток. Площадь электродов в этом случае всегда во много раз превышает размеры единичной клетки. Вместе с тем при реконструкции клеток в связи с переносом генетического материала оказалось целесообразным использовать метод локального электрослияния, когда два электрода непосредственно подводят к паре клеток, которые предполагается сливать. Такие приемы, например, были использованы при слиянии бластомеров ранних эмбрионов млекопитающих с формированием полиплоидных клеток.
4. Реконструкция зигот млекопитающих при сочетании микрохирургии и электростимулируемого слияния клеток
Интересные результаты по применению метода электростимулируемого слияния клеток были получены в последнее время на эмбриональных клетках млекопитающих.
Проблема пересадки ядер зиготы или реконструкция клетки - одна из центральных в биологии, так как позволяет подойти к решению ряда принципиальных вопросов биологии развития. Успехи, в этой области, достигнутые на зародышах амфибий, рыб и беспозвоночных, вселяли, в частности, уверенность в принципиальную возможность клонирования организмов. Особый интерес представляют подобные исследования на зародышах млекопитающих. Однако опыты по пересадке ядер у зародышей млекопитающих технически существенно сложнее, чем у зародышей рыб и амфибий.
Яйцеклетки млекопитающих значительно более чувствительны к микрохирургическим манипуляциям, связанным с удалением и введением в них ядер. Инъекционный способ введения кариопластов приводит, как правило, клетку к гибели. Подобные особенности зигот млекопитающих вероятнее всего, связаны с тем, что их объемные размеры в несколько тысяч раз меньше, чем объемные размеры зигот амфибий и рыб. В соответствии с этим при проколе поверхностной мембраны микроинструментом для удаления и введения ядер зиготы млекопитающих испытывают несравненно большее повреждение, чем зиготы рыб и амфибий. Такое повреждение поверхностной мембраны практически всегда приводит к гибели клетки млекопитающих в связи с необратимым нарушением гомеостаза.
Была предложена методика, которая не требовала пенетрации микропипеткой цитоплазматической мембраны клетки. Введение ядра донора в энуклеированную зиготу достигалось с помощью вируса Сендай.
Эксперименты были проведены на мышах CBWA альбиносах-тетрагибридах. В качестве приемных самок использовали гибриды Fi (СВАХ ХС57) (aqouti). Мышей получали из питомника "Светлые горы". Одноклеточные зародыши на стадии пронуклеусов, практически лишенные кумулюса, получали от мышей CBWA первого дня беременности. Для вымывания и культивирования зигот использовали модифизированную среду Виттена. Для микрохирургии эту среду разбавляли на 20% дистиллированной водой с целью поддержания тургора клеток. Кроме того, в среду для операций добавляли цитохалазин В в дозе 5мкг/мл. В специальную микрокамеру типа Фонбрюна помещали 10-15 зигот в среду для микрохирургии. Время инкубации зигот в среде до операции не превышало 15 мин. Все манипуляции проводили при комнатной температуре.
При проведении микрохирургической операции выяснилось, что после прокола зоны пеллюцида микроинструмент внедряется в глубь клетки, не повреждая поверхностную мембрану клетки. Это определяется главным образом действием цитохалазина В. Клетка сохраняет жизнеспособность до тех пор, пока не нарушена целостность цитоплазматической мембраны. Кариопласт формируется за счет всасывания пронуклеусов вместе с цитоплазмой и наружной поверхностной мембраной в микропипетку. Происходит как бы искусственное деление клетки. Попытки вернуть кариопласт обратно в зиготу не удаются. Мембрана кариопласта контактирует с зиготой и может так сохраняться в течение достаточно долгого времени (1-2 суток), но слияния не происходит. При этом энуклеированная зигота не делится, а кариопласт частично фрагментирует. Для реконструкции зиготы необходимо их истинное слияние. Для слияния такой клеточной пары были использованы электрические стимулы вместо вируса Сендай. Электрослияние было проведено в той же среде, в которой оперировали зиготы.
Предполагают, что слияние двух соседних клеток при подаче на них внешнего электрического поля происходит за счет необратимого электрического пробоя контактирующих мембран. Очевидно, что решение этой задачи связано с поисками таких способов приложения электрического поля, при которых максимум падения напряжения приходится на мембраны в области контакта. Было опробовано несколько вариантов с использованием внеклеточных электродов.
Импульс тока подавали в момент, когда кариопласт, вводимый под зону пеллюцида, приходил в контакт с энуклеированной зиготой. Во всем диапазоне использованных токов слияния не достигалось. При подаче импульсов тока внутри микроинструмента возникали достаточно сильные и направленные электрофоретические смещения среды, что приводило к разрушению кариопласта. Возможно, этому способствовал и локальный нагрев.
Микроэлектрод подводили в область контакта и пропускали импульсы тока. При этом наблюдали единичные случаи слияния кариопласта с энуклеированной зиготой, однако при удалении электрода, из области контакта либо кариопласт, либо зигота разрушались. Вероятно, за счет высокой плотности тока вблизи кончика микроэлектрода происходит локальный нагрев и прилипание микроэлектрода к поверхности кариопласта или зиготы.
В следующем варианте использовали большие электроды, когда сами электроды и расстояние между ними в несколько раз превышало размеры клетки. В большинстве случаев вскоре после слияния наблюдали гибель реконструированной зиготы. Очевидно, при таком способе необратимый пробой мембраны происходил не только в области контакта кариопласта с энуклеированной зиготой.
Наиболее удачным оказался последний вариант с электродами, у одного из которых диаметр торца был 70-100 мкм, у другого 20-30 мкм, что примерно соответствовало размерам энуклеированной зиготы и кариопласта. Существенно, что электроды были тщательно изолированы, за исключением торцов. Доля удачных электрослияний при этом составляла 75%, а с электродами без изоляции только 25%.
При проведении основной серии опытов с использованием последнего варианта прооперированную зиготу с введенным под зону пеллюцида кариопластом помещали вплотную между двумя электродами таким образом, чтобы плоскость контакта цитопласта и кариопласта была перпендикулярна прямой, соединяющей кончики электродов. Каждую клеточную пару отдельно подвергали действию электрических стимулов. Оптимальные параметры электростимуляции были следующими: напряжение на выходе стимулятора (ЭСЛ-2) 20 В, длительность импульсов 0,1 мс, расстояние между электродами 100-150 мкм.
Специальные измерения показали, что в используемой среде при подаче импульса 20 В длительностью 0,1 мс, при котором происходит слияние на межэлектродном расстоянии, примерно равном диаметру объекта (100 мкм). падение напряжения составляет 0,6 В. Эта величина возрастала до 1 В при введении между электродами объекта. Таким образом, на каждую из четырех мембран: двух в области контакта и двух, прилегающих к электродам, приходится в среднем по 0,25 В в начальный момент подачи импульса тока (до пробоя).
Можно предполагать, что возникновение пробоя в любой из указанных четырех мембран приведет к перераспределению потенциала, его возрастанию на остальных мембранах. Это будет способствовать возникновению пробоя в них. Таким образом, при электрослиянии пробой, вероятно, возникает во всех четырех мембранах, и только в области тесного контакта мембран он необратим.
Большинство клеток сливалось после одного импульса.
Можно отметить ряд моментов. Сразу же после электрического стимула наблюдается увеличение площади контакта между кариопластом и цитопластом, что является начальным этапом процесса слияния. Дальнейшее протекание процесса слияния характеризуется постепенным размыванием или растворением контактирующих между собой мембран. Время между электрическим стимулом и визуально наблюдаемыми признаками начала процесса слияния варьирует от 1-15 с до 20-30 мин, т.е. на три порядка. Основное количество клеток сливается в течение 1-10 мин. К неслившимся клеткам прилагали дополнительно серию импульсов (два-три импульса с интервалом в несколько секунд), что заметно увеличивало процент слияния.