Реферат: Молекулярно-генетичні маркери раку молочної залози у осіб різних вікових груп
Від усіх пацієнток було отримано інформовану згоду на проведення дослідження, після чого у них брали пробу венозної крові або проводили дослідження пухлини молочної залози.
Для всіх пацієнток складався родовід з подальшим проведенням клініко-генеалогічного аналізу за стандартною методикою (Бочков Н.П., 2002).
Для визначення ризику розвитку РМЗ у жінок з України було проведено аналіз даних Національного канцер-реєстру України за 2004 рік (розділ статево-вікові показники захворюваності на рак молочної залози). Визначення відносного ризику (RR) розвитку РМЗ в залежності від віку здійснювали за допомогою статиcтичної програми EpiCalc2000, v.1.0.
Молекулярно-генетичні дослідження біологічного матеріалу від українських пацієнток виконувались в лабораторії кафедри медичної генетики Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика, іранських пацієнток – в лабораторії Інституту молекулярної генетики та біотехнологій - м. Тегеран, Іран.
При виконанні лабораторної частини роботи були використані різні методи депарафінування гістологічних зрізів пухлин молочної залози та різні методи виділення ДНК з депарафінізованих тканин (CaoW. Etal., 2003; CouraR. etal., 2005). Депарафінізовані тканини ресуспендували у лізуючому буфері з протеїназою К та інкубували до повного розчинення тканини. Виділення ДНК з лейкоцитів периферичної крові здійснювалось близькими за складом комерційними наборами фірм CinaGene (Іран) та АмпліСенс (Росія) згідно рекомендаціям фірми-виробника.
Мутації 5382insC та 185delAG у гені BRCA1 , 6174delT у гені BRCA2 виявляли методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції відповідно до публікації Chan P.C. з співавт. (1999), мутацію мтДНК4977 у мітохондріальній ДНК – відповідно до публікації Zullo S.J. (2000). Використовували наступний режим ампліфікації: денатурація при 94°C протягом 5 хвилин, 35 циклів ампліфікації по наступній програмі: 94°C – 0,5 хв., 55 °C – 1 хв., 72°C – 0,35 хв., завершальний синтез – 5 хвилин при 72°С. Для детекції продуктів ампліфікації застосовували горизонтальний електрофорез у 2% агарозному гелі.
Імуногістохімічне дослідження за допомогою антитіл до рецепторів естрогенів та прогестерону у пухлинах молочної залози проводились в лабораторії патологічної анатомії шпиталів Хатам та Багіатоллах, зав. проф. М.Хашемі та М.Х.Акбарі (м.Тегеран, Іран) для іранських пацієнток та в лабораторії патологоанатомічного відділення Київської міської онкологічної лікарні, зав. канд.мед.наук Л.М.Захарцева.
Статистичний аналіз одержаних результатів включав обчислення значень критерію хі-квадрат (чІ), z-критерію та вирахування відносин шансів (Odds Ratio, OR) за допомогою комп’ютерних програм EpiCalc2000, v.1.0. та Epi Info(ТМ) 2005.
Результати дослідження та їх обговорення
На основі аналізу матеріалів Національного канцер-реєстру України за 2004 рік було розраховано відносний ризик розвитку РМЗ для жінок в залежності від віку. Ці результати представлені на рисунку 1. За досліджуваний період в Україні було зареєстровано 15863 нових випадків РМЗ у жінок у віці від 15 років і більше, стандартизований показник захворюваності склав 38,3 на 100000 жіночого населення. Показник захворюваності у групі дівчат та жінок 15-19 років склав 0.2 на 100000 (RR прийнято за 1), потім зі збільшенням віку показник захворюваності зростав, досягаючи максимуму у вікових групах 55-59 і 65-69 років (148,8 на 100000 и 154,0 на 100000) (RR відповідно становив 263 і 273).
Як показав наш аналіз офіційних статистичних даних, абсолютне число нових випадків РМЗ в Ірані протягом року становило 4742, стандартизований показник захворюваності склав 17,1 на 100000 жіночого населення. При цьому, як і в Україні, в Ірані були відмічені аналогічні рівні зростання частоти захворюваності жінок старших вікових груп, проте особливості формування статистичних даних про частоту онкологічної патології в Ірані не дозволили провести зіставлення коефіцієнту відносного ризику в двох країнах.
Рак молочної залози – це мультифакторіальне захворювання, на виникнення якого впливає комплекс факторів, тиск цих факторів збільшується з віком, і підвищення частоти хворих на РМЗ в старших вікових групах є очікуваним. Проте жінки до 40 років, у яких РМЗ часто має важкий і швидкий перебіг, за віковою ознакою не включаються до групи ризику, яка підлягає плановим профілактичним оглядам. Тому відокремлення цієї групи пацієнток можливе, в першу чергу, за рахунок використання в схемах їх обстеження високоінформативних діагностичних маркерів. Це перш за все проведення клініко-генеалогічного аналізу та застосування молекулярно-генетичних досліджень.
За результатами клініко-генеалогічного аналізу, сімейні випадки захворювання родичів І та ІІ ступеню спорідненості на рак молочної залози (СРМЗ) становили 32,1% у пацієнток з Ірану (рис.2) та 28,6% – з України.
Як було показано вище, ризик розвитку захворювання на РМЗ в загальній популяції збільшується з віком, в той час як для сімейних випадків РМЗ максимальні величини відносного ризику було виявлено нами у віковій групі до 55 років (табл.2). Коефіцієнт RRдля жінок до 35 років у 2 рази перевищує такий у порівнянні з особами старше 76 років.
Використання патологоанатомічного архівного матеріалу, який зберігається в блоках, пов’язане з дедалі більш частою потребою ретроспективного аналізу молекулярно-генетичних маркерів. Стандартні методи виділення ДНК з матеріалу гістологічних зрізів пухлин молочної залози, які застосовувались на початку нашої роботи, давали високий відсоток деградованої ДНК, що обмежувало можливості використання гістологічних зрізів тканин пухлин для дослідження молекулярно-генетичних маркерів, що було основною метою роботи.
Для вибору оптимального методу видалення парафіну та оцінки ефективності подальшої реакції ампліфікації було використано 20 зразків гістологічних зрізів товщиною 20 мкм пухлин молочної залози жінок, які були прооперовані з приводу РМЗ. Зрізи розміщували у мікроцентрифужні пробірки,додавали 200 мл буферного розчину (тріс-HCl, pН 9,0, 0,5% Тween-20), паралельно проводили різні процедури видалення парафіну:
1) нагріванням зразка у мікрохвильовій печі протягом 45-60 сек. при потужності 650 w,
2) нагріванням зразка в автоклаві протягом 20 хвилин при температурі 120 °C,
3) експозицією зразка у ксилолі протягом 30, 60 і 120 хвилин (стандартний метод).
Для виділення ДНК після депарафінізації зрізів використовували два варіанти інкубації матеріалу з протеїназою К :
1) при 37 °С протягом 12 годин,
2) при 57 °С протягом 3 годин.
При порівнянні ефективності виділення ДНК з гістологічних зрізів різними методами найкращі результати ПЛР було отримано при поєднанні способу видалення парафіну нагріванням в мікрохвильовій печі з інкубацією тканини при температурі 57 °С (табл. 3).
При порівнянні кількості позитивних результатів ампліфікації генів BRCA 1/2 позитивний результат ПЛР виявлено у 70% випадків (14 з 20).Різниця ефективності склала 35% (P <0,03).
Вибір можливих молекулярно-генетичних маркерів для визначення ризику розвитку РМЗ базувався на відомостях про значну роль мутацій в генах BRCA 1 та BRCA 2 у виникненні цієї патології. Були вибрані мутації 5382insС, 185delAG в гені ВRCA1 і мутація 6174delT в гені ВRCA2, що визнані мажорними для європейських популяцій.
При молекулярно-генетичному обстеженні 120 хворих на РМЗ з України мутації в генах BRCA 1 та BRCA 2 були виявлені у 13 жінок (11,40%). У 10 пацієнток була виявлена мутація 5382ins у гені BRCA 1 (8,33%), у 2 пацієнток з 45 проведених обстежень – мутація 185delAG у гені BRCA 1 (4,44%), у 1 пацієнтки з 49 проведених обстежень – мутація 6174delТ у гені BRCA 2 (2,04%). При вивченні розподілу пацієнток - носіїв мутацій у генах BRCA по віку максимальне число мутацій було виявлено у віковій групі 31-40 років. Це відповідає літературним даним про те, що для BRCA -асоційованих форм злоякісних пухлин характерним є ранній вік початку захворювання [BillackB., MonteiroA., 2005].
При молекулярно-генетичному обстеженні 120 хворих на РМЗ з України мутації в генах BRCA 1 та BRCA 2 були виявлені у 13 жінок (11,40%). У 10 пацієнток була виявлена мутація 5382ins у гені BRCA 1 (8,33%), у 2 пацієнток з 45 проведених обстежень – мутація 185delAG у гені BRCA 1 (4,44%), у 1 пацієнтки з 49 проведених обстежень – мутація 6174delТ у гені BRCA 2 (2,04%). При вивченні розподілу пацієнток - носіїв мутацій у генах BRCA по віку максимальне число мутацій було виявлено у віковій групі 31-40 років. Це відповідає літературним даним про те, що для BRCA -асоційованих форм злоякісних пухлин характерним є ранній вік початку захворювання [BillackB., MonteiroA., 2005].
Висновок про те, що наявність мутацій у генах BRCA, може бути використане як молекулярно-генетичний маркер ризику розвитку РМЗ для жінок молодого віку, підтверджує і розрахунок відносного ризику розвитку РМЗ у осіб, що мають мутації у генах BRCA (рис.3). Представлена на рисунку 3 діаграма показує зменшення значень коефіцієнту RR з віком жінок з РМЗ при наявності мутантних алелів генів BRCA , на противагу найбільшим значенням відносного ризику у осіб старших вікових груп при урахуванні лише вікової характеристики пацієнток (рис.2).
3 з 34 (9%) обстежених молекулярно-генетичними методами пацієнток з РМЗ із Ірану була виявлена мутація 5382insС у гені BRCA 1 (рис.4). При цьому ні в одному випадку мутація 5382insС не була виявлена у осіб з несімейним РМЗ, а частота цієї мутації в групі сімейного РМЗ склала 19%. Вік пацієнток, що мали мутацію в гені BRCA , також не перевищував 45 років. Мутації 185delAG в гені ВRCA1 і 6174delT в гені ВRCA2 не були знайдені ні в одному випадку.