Реферат: Потенциометрический и амперометрический иммуноанализ
Электрохимическое определение фенола осложняется загрязнением поверхности электрода вследствие электрополимеризации феноксильных радикалов, образующихся в результате одноэлектронного окисления фенола.
Осложнения могут возникнуть* также при работе с биологическими образцами из-за адсорбции белков на электроде, сопровождающейся уменьшением измеряемой силы тока. Подобные проблемы стимулировали создание таких методик электрохимического иммуноферментного анализа, в которых амперометрическому определению продуктов ферментативных реакций предшествует хроматографическое разделение смеси. Целью таких методик является попытка решить проблему загрязнения электродов-, а также повысить чувствительность анализа.
Разработана методика конкурентного гетерогенного иммуноферментного определения дигоксина с щелочной фосфатазой в качестве метки и с определением продукта ферментативной реакции фенола в тонкослойной электрохимической ячейке с помощью проточно-инжекционного анализа с электрохимическим детектором или жидкостной хроматографии с электрохимическим детектором.
В системе ПИА-ЭХ пробу непосредственно инжектируют в тонкослойную ячейку, тогда как в системе ЖХ-ЭХ фенол задерживается на предколонке с октилдецилсиланом. Каждая система имеет свои достоинства. Например, в ПИА-ЭХ достигается достаточно большая пропускная способность, но меньшая чувствительность, так как инжекция порождает емкостный ток, даже если компоненты раствора субстрата при используемых потенциалах электрохимически неактивны. Емкостный ток обусловлен небольшими различиями между матриксом раствора субстрата и буферной неподвижной фазой. С другой стороны, при ЖХ-ЭХ фенол отделяется от других компонентов смеси, в том числе и тех, с которыми связано возникновение емкостного тока, но это достигается только эа счет значительного увеличения продолжительности анализа.
Калибровочную кривую для дигоксина можно построить путем определения пиковых токов растворов сыворотки, содержащих известное количество этого препарата. В варианте ЖХ-ЭХ достигнут предел обнаружения 50 пг/мл; в клинических анализах результаты хорошо согласуются с результатами РИА.
Разработаны также методики конкурентного иммуноферментного анализа в варианте ЖХ-ЭХ для определения кислого а-гликопротеина и иммуноглобулина G. В последней работе достигнут предел обнаружения около 5 нг/мл. Значительно большую чувствительность Обеспечивает двухсайтовый анализ. Так, при определении IgG кролика с щелочной фосфатазой в качестве ферментной метки достигнут предел обнаружения около 10 пг/мл.
В гетерогенном электрохимическом иммуноферментном анализе полезной оказалась и высокоэффективная иммуноаффинная хроматография. Здесь колонку для ВЭИХ, представляющую собой, по сути дела, реактор многократного использования, заполняют антителами, ковалентно связанными с твердым носителем. При применении ферментной метки активность связанного фермента можно измерить путем введения субстрата и определения электроактивного продукта с помощью ЖХ-ЭХ-детектора. Режим проточно-инжекционной хроматографии позволяет тщательно контролировать состояние иммуносорбента, что очень важно для достижения хорошей воспроизводимости. Иммуносорбентные колонки стабильны по меньшей мере в течение 3 месяцев. Такой принцип положен в основу двухсайтовой иммуноферментной методики типа ELISA для определения IgG, в которой роль вторичных антител выполнял конъюгат анти-IgG козла с глюкозооксидазой, а определяли перок с ид водорода, образующийся после введения глюкозы в аффинную колонку. При времени инкубации менее 30 мин достигнута чувствительность 10-12 - 10-15М.
Недавно описана методика быстрого определения hCG с помощью двухсайтового иммуноферментного анализа и иммобилизованных на электроде антител. Активность глюкозооксидазы, связанной с вторыми антителами, определяли электрохимически с помощью медиатора переноса электронов, не прибегая к стадии отдельной инкубации. Средняя чувствительность hCG была равна 9 м. ед. /л.
Все описанные выше методики относятся к числу гетерогенных. Известны и гомогенные методы иммуноферментного анализа с амперометрическим определением. Так, концентрацию антиэпилептического препарата фенитоина можно измерять с помощью конкурентного иммуноферментного анализа, основанного на принципе ПИА, и амперометрического определения NADH. В качестве метки обычно применяют глкжозо-6-фосфатдегидрогеназу, катализирующую восстановление NAD+ до NADH. Оптимальный диапазон определения NADH равен 0,01 его концентрации, создающейся за время, необходимое для каждого анализа. Поэтому непосредственно перед введением в проточную систему пробу необходимо разбавить примерно в 100 раз.
Н-го и др. разработали вариант гомогенного амперометрического иммуноферментного анализа, основанный на ингибировании антителами превращения апоферментов в холоферменты Модельным определяемым соединением была 2,4-динитрофенила-минокапроновая кислота, а в качестве ферментной метки применяли глюкозооксидазу. Катализируемое последней образование пероксида водорода при окислении глюкозы в присутствии кислорода контролировали амперометрически.
Принцип анализа представлен на рис.7. Определяемое вещество DNP-ACA и DNP-апоглюкозооксидаза конкурируют за данное количество антител против DNP. При добавлении флавинадениндинуклеотида последний может связываться со свободной DNP-CAGO с образованием обладающего ферментативной активностью комплекса DNP-CAGO: FAD, который катализирует образование Н2 02 из 02 в присутствии глюкозы. Таким образом, скорость образования Н2 02 является мерой концентрации свободной DNP-CAGOи, следовательно, концентрации DNP-
АСА в пробе. Концентрацию Н2 0, определяют амперометрически на платиновом электроде при + 700 мВ относительно электрода сравнения Ag/AgCl. Рабочий диапазон анализа равен 2-40 мкг/мл.
Вполне успешно использовавшийся для определения гаптенов гомогенный иммуноферментный анализ значительно реже применяли для определения антител. Недавно описаны такие методики для определения антител к лекарственным препаратам. Цель разработки заключалась в упрощении существующих методик определения антител при сохранении требуемой чувствительности. Метод основан на ингибировании ферментативной активности конъюгата антиген-фермент определяемыми антителами, а в качестве фермента применяли глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу:
Ферментативную активность измеряли амперометрическим определением скорости окисления NADH на платиновом электроде. Возможности методики были продемонстрированы на примере модельной системы лидокаин-антитела к лидокаину, калибровочная кривая которой получена вплоть до ианограммовых количеств антител. Абсолютная чувствительность анализа зависит от начального количества конъюгата антиген-фермент. Показано, что возможное загрязнение платинового электрода, обусловленное адсорбцией белков, и перекрестные реакции антител практически не влияют на результат анализа.
Неферментативные электроактивные метки. Многообещающим направлением в амперометрическом иммуноанализе представляется применение металлсодержащих соединений. К таким меткам предъявляются следующие требования:
1) хорошие электрохимические свойства,
2) нечувствительность к рН в рабочем диапазоне,
3) растворимость в водных средах,
4) отсутствие в биологических жидкостях,
5) устойчивость и в окисленной, и в восстановленной формах.
Одним из первых производных ферроцена в качестве метки для антител был применен 3-карбокси-4-ферроценил-фенилизотиоцианат, выполняющий роль маркера в электронной микроскопии. Каис и др. впервые предложили использовать в иммуноанализе металлсодержащие метки. Они метили низкомолекулярные гаптены в основном металлоорганическими соединениями. В принципе любой металл может реагировать с подходящим органическим лигандом, однако Каис уделил основное внимание соединениям ртути и железа, хотя были получены также гаптены, меченные хромом, медью, палладием, кобальтом, марганцем, платиной и даже золотом. Иммуноанализ с металлоорганическими метками аналогичен РИА. В этом методе необходимо проводить разделение связанной и свободной фракций метки, а содержание металла в каждой фракции можно определить методом атомно-абсорбционной спектроскопии. К сожалению, хотя металлсодержащие метки и менее опасны, чем радиоактивные, методика анализа весьма сложна и требует довольно дорогого аналитического оборудования. Чувствительность анализа сравнима с чувствительностью простейшего гомогенного метода иммуноферментного анализа типа EMIT.
В 1979 г. две группы исследователей опубликовали статьи, в которых были описаны два варианта гомогенного амперометрического иммуноанализа с неферментативными электроактивными метками. Модельными антигенами в обеих работах были небольшие молекулы. Хейнеман и др. в качестве метки для определения эстриола использовали ацетат ртути. Уровень этого гормона в плазме и моче соответствует определенным стадиям беременности. Силу тока, возникающего от метки на ртутном электроде, измеряли с помощью дифференциальной импульсной полярографии. Последующее добавление антител против эстриола приводит к уменьшению пикового тока, обусловленного волной, которая отвечает восстановлению ацетата ртути при - 300 мВ. Связывание конъюгата эстриола с ацетатом ртути и со специфическими антителами предотвращает восстановление метки при - 300 мВ, что устраняет необходимость разделения связанного и свободного меченого антигенов. Добавление немеченого эстриола к раствору, содержащему связанный с антителами конъюгат эстриол - ацетат ртути, приводит к вытеснению меченного металлом гаптена. Степень вытеснения последнего можно контролировать по увеличению тока. Так как восстановление меченного металлом гаптена происходит при потенциале, при котором становится заметным восстановление кислорода, то для устранения побочных реакций необходимо тщательное удаление кислорода из проб.
В другой работе описана методика определения морфина методом гомогенного иммунохимического анализа с производным ферроцена в качестве метки. Коныогат ферроцена с морфином окисляется на стеклоуглеродном электроде при + 500 мВ относительно стандартного каломельного электрода. Добавление антител против морфина приводит к связыванию конъюгата, что сопровождается уменьшением тока окисления. Вытеснение конъюгата из комплекса с антителами при добавлении кодеина приводит к увеличению тока окисления.
Необходимым условием для осуществления гомогенного иммуноанализа такого типа, по-видимому, является различие в коэффициентах диффузии между свободным меченым антигеном и антигеном, связанным с антителами. Следовательно, такие методики могут в общем случае применяться тогда, когда молекула антигена значительно меньше, чем антитело, так как это приводит к большему различию в коэффициентах диффузии между связанным и свободным антигеном.