Выбор оптимального праймера для ПЦР зависит от 5 '- и 3 '-кон­цевых последовательностей амплифицируемого фрагмента ДНК. Кроме того, для встраивания ПЦР-продукта в полилинкерный сайт вектора М13 в 5'-конец праймеров должны быть включены подходящие рестрикционные сайты. В этом случае ПЦР-амплификация с последующей рестрикцией продукта позволит про­вести его встраивание в ДНК М13, рестрицированную тем же ферментом. В разные концы амплифицируемого фрагмента луч­ше включать сайты для разных рестриктаз, поскольку это позво­лит избежать отжига векторной ДНК самой на себя и обеспечит положение клонированной вставки в определенной ориентации (так называемое направленное клонирование). При подборе праймеров необходимо учитывать следующие факторы.

а. Следует убедиться в том, что амплифицируемое семейство генов не содержит консервативного внутреннего рестрикционного сайта, идентичного сайту, включенному в праймер.

б. После включения рестрикционного сайта 5' - конец праймера нужно удлинить, в противном случае рестриктаза не будет расщеплять праймер. Необходимая для каждого фермента длина выступающего участка и время рестрикции указаны в каталоге фирмы New England BioLabs.

Перед секвенированием двухцепочечную рекомбинантную ДНК М13 необходимо перевести в одноцепочечную форму. Для этого ее вводят путем трансформации в компетентные клетки E. с oli . Бляшки, содержащие одноцепочечные рекомбинантные фаги, необходимо выколоть, нарастить в бактериальной культуре и депротеинизировать.

Затем переносят культуру в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 минут. Переносят 1 мл супернатанта (содержащего чистый фаг) во вторую пробирку на 1,5 мл, добавляют 200 мкл полиэтиленгликоля и инкубируют при комнатной температуре как минимум 15 минут. Собирают фаг центрифугированием в течении 5 минут при 12 000 g и отбирают супернатант. Быстро повторяют центрифугирование и полностью удаляют все следы супернатанта. Затем осаждают ДНК ацетатом натрия, промывают ее 70%-ным этанолом и высушивают под вакуумом. Растворяют ДНК в 30 мкл воды. Полученная ДНК представляет собой одноцепочечную матрицу для секвенирования.

Ниже приведена конкретная методика секвенирования:

Материалы

• 5 х реакционный буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl₂ , 250 мМ NaCl

• Буфер для разведения фермента: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ДТТ, 0,5 мг/мл БСА

• 5 х смесь для мечения: по 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP

• Смесь для ddG-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddGTP, 50 мМ NaCl

• Смесь для ddA-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddATP, 50 мМ NaCl

• Смесь для ddC-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddCTP, 50 мМ NaCl

• Смесь для ddT-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddTTP, 50 мМ NaCl

• Стоп-раствор: 90% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилолцианол

• Универсальный праймер для секвенирования - 40 (0,5 пмоль/ мкл)

• [³⁵ S]dATPS (1 мКи/37 МБк в 100 мкл) (Amersham, UK; в со­став набора не входит)

• 0,1 М ДТТ

Методика

Все реактивы добавляют с помощью диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600), соединенного с адаптером и шприцом 1710 с газовым затвором. Смесь для мечения предварительно раз­бавляют в пять раз.

1. Для каждой секвенируемой матрицы смешивают в микроцен-трифужной пробирке на 1,5 мл для получения праймерной смеси 6 мкл воды, 1 мкл универсального праймера и 2 мкл реакционного буфера.

2. Размечают микроплашку Falcon 3911. В верхней ее части наносят номера клонов, а слева, сверху вниз, — буквы TCGA.

3. На дно каждой ячейки наносят 2 мкл праймерной смеси, на боковые стенки — по 2 мкл раствора секвенируемой матрицы и центрифугируют плашку. Накрывают ее пленкой Saran® и крышкой и помещают в водяную баню с температурой 70°С на 5 мин. Охлаждают плашку на столе (за это время происходит отжиг праймера и ДНК М13).

4. Пока плашка охлаждается, готовят смесь для мечения. Для это­го в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл вносят 0,5 мкл ³⁵ S-dATP, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл разведенной смеси для мече­ния и 3,5 мкл воды.

5. Размечают поликарбонатную микроплашку Techne 96® так же, как первую плашку, и в ячейки в ряду "Т" вносят по 2 мкл смеси для ddT-терминации. Аналогичным образом вносят смесь для терминации в ячейки остальных рядов и поме­щают плашку в термостат для микроплашек с температурой 42°С.

6. После охлаждения плашки (п. 3) в течение 30 мин добавляют к смеси для мечения (для каждой матрицы) последовательно 1,77 мкл буфера для разведения фермента и 0,22 мкл фермента Sequenase® II. (Это позволяет держать фермент Sequenase® II вне холодильника минимальное время.)

7. По 2 мкл этой смеси наносят на боковую стенку ячеек, со­держащих праймерную смесь, и центрифугируют плашку для перемешивания компонентов. Включают секундомер.

8. Через 2 мин начинают переносить раствор из ячеек первой плашки в соответствующие ячейки предварительно нагретой и помещенной в термостат поликарбонатной плашки. Для этого используют обычную микропипетку, быстро меняя наконеч­ники после каждой ячейки (помните, что использованные на­конечники радиоактивны).

9. После того как перенесен раствор из последней ячейки, вклю­чают секундомер и в наконечник на шприце Hamilton набира­ют стоп-раствор.

10. Через 5 мин наносят по 5 мкл стоп-раствора на боковую стенку каждой ячейки и центрифугируют плашку. После центрифуги­рования плашку, закрытую крышкой, можно хранить в моро­зильнике до использования (при - 20°С ³⁵ S-продукты можно хранить в течение недели).