Реферат: Влияние вакуумного ультрафиолета на гемоглобин

Оптическая спектрофотометрия - один из самых эффективных методов изучения растворов гемопротеидов. Он является основным при изучении различного рода превращений биополимеров и позволяет исследовать способность молекул поглощать и трансформировать энергию света, что лежит в основе многих, прежде всего фотобиологических процессов.

При анализе структурных и функциональных свойств макромолекул особенно полезно использование методов, в основе которых лежит регистрация их электронных спектров поглощения, с помощью которых можно проследить изменения, происходящие в молекуле или её составных частях при действии её физико-химических факторов.

Как белок, гемоглобин имеет две полосы поглощения в УФ-области спектра с максимумами при 220 и 275 нм. Коротковолновая полоса поглощения белка, природа которой дискутируется, обладает высокой интенсивностью и обусловлена, вероятно, наличием в его структуре пептидных связей. Длинноволновая полоса есть результат совокупного поглощения энергии квантов света ароматическими аминокислотами (триптофан, тирозин, фенилаланин), а также цистеином. В зависимости от источника получения гембелка и от конформационого состояния глобина положение и интенсивность указанных полос поглощения могут в значительной степени изменяться.

За поглощение света в видимой области спектра ответственна порфириновая часть макромолекулы. Сильное влияние на полосы поглощения оказывают спиновое состояние системы и наличие лигандов с различным лигандным полем.

Полоса Соре отражает переходы типа π-π*- переходов порфиринового кольца и частично типа переноса заряда. Низкоспиновые полосы 542 и 546 нм иногда относят к синглет-триплетным переходам. Кроме того, в спектре поглощения оксигемоглобина присутствует полоса с λmax=342 нм, обусловленная особенностями железопофирина.

Порфирин является плоской сопряженной системой, относящейся к группе симметрии D4h, для которой в соответствии с правилами отбора разрешены переходы в возбужденные состояния eu, расщепленные на два уровня: b2u и b3u. В этом случае полосы в видимой части спектра принадлежат замкнутой оболочке порфирина.

Простетическая группа и соединенные с ней группы глобина представляет собой уже структуру с симметрией типа октаэдра. Введение атома металла несколько изменяет основное состояние системы, которое становится для низкоспинового комплекса еg, а для высокоспинового – А+g. При изменении спиновости гемопротеидов меняется положение всех трех основных полос поглощения в видимой области спектра, что может наблюдаться под влиянием физических и химических агентов.

1.3 Биологическое действие вакуумного ультрафиолетового излучения

Изучение биологических эффектов после воздействия ВУФ – света на биосистемы сопряжено с учетом особенностей его действия на макромолекулы. Во-первых, обладая энергией порядка 6 – 120 эВ, кванты этого вида излучения способны вызвать фотодиссоциацию и фотоионизацию биомолекул. Во-вторых, из-за поглощения ВУФ-излучения кислородом воздуха и растворителем, в качестве которого в большинстве биосистем выступает вода, указанный вид излучения обладает малой проникающей способностью, поэтому для проведения исследований на молекулярном уровне необходимо использовать тонкие слои веществ порядка 10^{-7 м.}

В ВУФ-области спектра основными процессами дезактивации высоковозбужденных состояний молекул являются люминесценция, фотодиссоциация, фотоионизация. Знание эффективности этих процессов может быть использовано для выяснения механизмов фотопревращений биомолекул при ВУФ-облучении. Объектами исследования могут также служить тонкие пленки и водные растворы нуклеиновых кислот с белками, АТФ, споры бактерий, штаммы дрожжей и другие биообъекты, пригодные для изучения действия ВУФ-излучения на молекулярном и клеточном уровнях.

Известно, что ВУФ-излучение с энергиями квантов 5 – 10 эВ (120 – 190 нм) вызывает фотолиз воды с образованием радикалов H·, OH· и eaq, как это происходит прилазерном УФ-фотолизе и γ -радиолизе. При достаточно малых концентрациях растворенных веществ (10 - 10 М/л) их поглощением в ВУФ-области спектра можно пренебречь по сравнению с водой, и фоторазрушение молекул происходит по косвенному механизму через ВУФ-фотолиз так же, как и в случае действия ионизирующего, например, γ-излучения. На однозначность косвенного механизма действия ВУФ-излучения в водных растворах биомолекул указывают данные по защите тимина от фотодеструкции при добавлении в облучаемую среду акцепторов радикалов воды: метанол, трет-бутанол, CdSO4. причем эффективность фотолиза уменьшается в ряду Тимин – тимидин - тимидинмонофосфат, что указывает на уменьшение вероятности атаки азотистого основания радикалами воды при включении в состав молекулы рибозофосфатных групп (как и для γ-излучения). Установлено, что фоторазложение молекул тимина с разрывом двойной связи тотального гистона более эффективно в водном растворе, чем в твердых образцах, что также подтверждает косвенный механизм действия вакуумного ультрафиолета через ВУФ-фотолиз воды. Таким образом, ВУФ-излучение действует на растворы так же, как и ионизирующее.

1.4 Действие вакуумного УФ-излучения на аминокислоты и

белковые системы

Исследования фотопроцессов, происходящих в белках и их компонентах под влиянием вакуумного УФ-излучения (λ<200 нм), имеют важное значение для выяснения механизма его биологического действия, а также связаны с проблемой абиогенного фотосинтеза биологических молекул в космическом пространстве и в период биохимической эволюции на Земле. Так, в работах Н.Я. Додоновой и соавт. (Н.Я. Додонова, А.И. Сидорова, 1961, 1962; Н.Я. Додонова, 1962) установлено, что при освещении смесей природных газов: аммиака, паров воды, метана и диоксида углерода светом водородной лампы с многолинейчатым и сплошным спектром в ВУФ-области происходит фотосинтез аминокислот, гидразина, формальдегида и мочевины.

Высказывается предположение, что формальдегид и мочевина являются промежуточными продуктами в процессе синтеза аминокислот. При этом действующая спектральная область при фотосинтезе аминокислот в смеси газов определена от 180 до 145 нм. Позже этими же авторами (Н.Я. Додонова, Н.М. Цыганенко, 1990; Н.Я. Додонова и соавт., 1994) было показано, что под действием вакуумного ультрафиолета в области 120 – 160 нм происходит усложнение биологически важных молекул. Анализ фотоустойчивости образующихся соединений к этому излучению проведен в работах (N.Ya. Dodonovaetal., 1982; М.Н. Киселева и соавт., 1989).

Выявление биологических эффектов ВУФ-излучения затруднено тем обстоятельством, что его кванты поглощаются кислородом воздуха, а также кварцем и стеклом. Кроме того, поскольку длина проникновения ВУФ-света в вещество невелика, для исследований на молекулярном уровне применяются пленки толщиной порядка 0,1 мкм. Известно, что при длинах волн, меньших 200 нм, вода характеризуется сильным поглощением, и водные растворы применяться не могут (L.R. Painteretal., 1969).

При действии вакуумного ультрафиолета на компоненты белков в них происходят одноквантовые процессы фотодиссоциации и фотоионизации. Пороговые значения фотоионизации полипептидов и белков составляют 8 эВ. При уменьшении длины волны возбуждения до 122 нм происходит увеличение эффективности фотоионизации белков, о чем свидетельствует увеличение квантового выхода инактивации до единицы (R. Settlowetal., 1959).

Для всех аминокислот основной вклад в полную ионизацию вносят процессы диссоциативной фотоионизации, причем в алифатических аминокислотах они связаны с разрывом связей, находящихся в β-положении к аминогруппе с сохранением заряда на осколке, содержащем атом азота, под действием квантов света с энергией до 14 эВ. Это указывает на удаление одного из электронов неподеленной пары атома азота при фотоионизации алифатических аминокислот. Потенциал ионизации этих аминокислот составляет 8,5 – 9 эВ. Для ароматических аминокислот характерно участие в ионизации π-электронов сопряженных систем. Присутствие гетероатома в боковой цепи молекулы облегчает процесс фотоионизации, поэтому потенциалы ионизации ароматических аминокислот ниже, чем для алифатических, и составляют для фенилаланина и тирозина 8,4 эВ, а для триптофана – 7,5 эВ (М.Е. Акопян, Ю.В. Логинов, 1967).

Исследования аминокислот в области 120 – 280 нм в слоях, полученных напылением в вакууме, позволили получить их спектры поглощения, люминесценции и оценить относительный спектральный выход люминесценции. Полосы у 120 и 160 нм в спектрах поглощения приписываются СООН-группе, а полосы у 140 и 190 нм – пептидной связи (И.П. Виноградов, Н.Я. Додонова, 1971). При возбуждении ароматических аминокислот монохроматическим светом с длинами волн 120 и 160 нм при 90 К в спектрах люминесценции указанных аминокислот наблюдаются полосы флуоресценции для триптофана, тирозина и фенилаланина с максимумами около 350, 320, 293 нм соответственно и полосы фосфоресценции 445, 410, 410 нм соответственно (И.П. Виноградов, Н.Я. Додонова, 1971а). На основании этого сделано предположение, что возможна передача энергии с пептидных связей на триптофан для триптофансодержащих белков только в области слабых n-π переходов пептидных связей на 230 нм, а не в области их наиболее интенсивного поглощения на 140 и 190 нм (И.П. Виноградов, Н.Я. Додонова, 1971б). Поглощение тирозином излучения ксеноновой и криптоновой ламп приводит к возбуждению как фенольного кольца названой аминокислоты, так и σ-связи боковой группы тирозина, что, по всей видимости, может привести к димеризации близко расположенных и соответственно ориентированных в кристаллической фазе молекул этой аминокислоты с образованием пептидных связей (Е.В. Хорошилова и соавт., 1991).

Анализ экспериментальных данных, касающихся фото- и радиационно-химических изменений биохимически важных соединений, позволил бы не только резистентные молекулы мономеров, но и наметить некоторые модельные подходы к установлению возможных путей эволюции структуры макромолекул, в частности, белков. Так, ВУФ-облучение (145, 175 нм) дипептидов тирозил-тирозина и глицил-триптофана, а также γ-облучение (Cs¹³⁷ ) глицил-триптофана приводит к деструкции как пептидных связей, так и аминокислотных компонентов дипептида. Устойчивость ароматических аминокислот и их дипептидов к ВУФ-излучению возрастает в ряду: глицил-триптофан – триптофан, тирозин – тирозил-тирозин. Эффективность деструкции триптофана и глицил-триптофана при γ-облучении приблизительно в 1000 раз больше, чем при ВУФ-излучении. При ВУФ-облучении, в противоположность действию γ-излучения, распад дипептида глицил-триптофана происходит более интенсивно, чем радиолиз триптофана вследствие избирательного поглощения ВУФ-излучения (145, 175 нм) пептидной группой (М.Ю. Петров, 1996).

В спектрах поглощения белков имеется полоса с максимумом около 190 нм, определяемая поглощением пептидных групп, и возрастающее от 160 нм в сторону коротких длин волн поглощение, связанное в основном с возбуждением электронов σ-связи аминокислотных остатков и S0-Sn переходами ароматических групп аминокислот, входящих в состав гистонов (Н.М. Цыганенко и соавт., 1987).

Таким образом, в ВУФ-области спектра поглощают алифатические аминокислоты, боковые группы ароматических аминокислот и пептидные группы белков, что дает возможность использовать эти сведения для анализа спектральных свойств белков после их облучения вакуумным УФ-светом

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось изучение закономерностей фотопревращений гемоглобина человека после воздействия ВУФ-излучения на молекулы этого транспортного белка крови.

Задачи исследования:

1) изучение методик приготовления тонких плёнок белка (~ 0,1мкм);

2) облучение тонких плёнок светом аргоновой лампы барьерного разряда в диапазоне длин волн 118-134 нм (λmax=126 нм);

3) изучение оптических свойств молекул гемоглобина человека, подвергшихся ВУФ-облучению в дозе 1,8 кДж/м².

2.2. Объект и методы исследования

2.2.1. Объект исследования

Объектом исследования стал гемоглобин человека (в концентрациях 10-10моль/л). Оксигемоглобин выделяли по методу, описанному Драбкиным Оксигемоглобин выделяли по методу, описанному Драбкиным (D.L. Drabkin, 1946) с модификациями Блюменфельда (Л.А. Блюменфельд, 1957). . В основе этого метода лежит явление гемолиза эритроцитов под действием воды.

2.2.2. Методика приготовления тонких пленок гемоглобина

Для получения тонкой пленки супернатант с концентрацией белка 10-10моль/л в объеме 10 мкл наносили на подложку из фтористого магния (d=30мм, толщина 1 мм(А.Н. Зайдель, Е.Я. Шрейдер, 1967)) и механически равномерно распределяли по всей её поверхности, затемоставляли до полного высыхания в суховоздушном термостате при t=37,00±0,01ºCв течение 60 мин. Толщина пленок белка, измеренная при помощи интерференционного микроскопа МИИ – 4 «Ломо» Россия, составляет 0,1 мкм составляла порядка 0,1 мкм.

Выбор фтористого магния в качестве материала дл нанесения образцов обусловлен широким интервалом спектрального пропускания от 0,113 до 9 мкм, что позволяет использовать их для изучения спектрофотометрическим методом структурных изменений молекул во всем оптическом диапазоне (Л.П. Шишацкая и др., 1988). Кристаллы фтористого магния более стойки, чем, например фтористый литий, к радиационному разрушению, тепловым механическим ударам, и, кроме того они не гигроскопичны.

2.2.3. Методика облучения тонких пленок белка

Полученные пленки белка облучали светом аргоновой лампы барьерного разряда в диапазоне длин волн 118-134 нм (λmax=126 нм) при помощи установки, собранной на кафедре биофизики и биотехнологии ВГУ. Указанная установка состоит из источника питания лампы, источника ВУФ-облучения, на который помещали подложку с нанесенным на нее образцом.

2.2.4. Регистрация спектров поглощения белковых образцов в видимой области

Измерение спектров поглощения пленок белка проводили на спектрофотометре СФ-46 в области длин волн 405, 413, 500, 542, 560, 576 и 630 нм. Контролем служила подложка из фтористого магния без образца.

2.3. Полученные результаты и их обсуждение