Реферат: Возможности ионообменной хроматографии
Главным образом потому, что фракционируемые вещества выходят из колонки в органическом растворителе, в то время, как для подавляющего большинства биологических веществ нормальная среда - водная.
В отличие от этого, предложенный позднее вариант так называемой "обращенной" или "обратнофазовой" распределительной хроматографии оказался весьма продуктивным. Здесь связывание молекул в неподвижной фазе происходит за счет их, пусть даже не ярко выраженных, но существующих гидрофобных свойств. (Например, наличия гидрофобных участков на поверхности белковой глобулы).
В неподвижной фазе создаются условия для хорошо выраженного гидрофобного взаимодействия. Обычно не с жидкостью, находящейся внутри гранул, поскольку органический растворитель трудно удержать внутри обычной гидрофильной матрицы (он ее не смачивает).
Гидрофобную среду создают либо на поверхности самой матрицы, заставляя частично гидрофобные молекулы в водной среде "прилипать" к этой поверхности, либо в тонкой пленке сильно гидрофобного растворителя, надежно связанного с матрицей.
Гидрофобизированные матрицы сефарозы
Первый вариант представлен, в частности, модифицированными матрицами на основе хорошо знакомой нам сефарозы. По множеству ОН-групп нитей агарозы ковалентной связью присоединяют гидрофобные радикалы.
Соответственно модифицированные матрицы именуются: "октил-сефароза", "октилдецил-сефароза" и "фенил-сефа-роза". Присоединенные радикалы создают сильно гидрофобную среду на поверхности самой сефарозной матрицы.
Разделять белки по силе гидрофобного взаимодействия с этой средой можно путем простой изократической элюции водным буфером. Однако разделение можно ускорить и улучшить, если вести элюцию линейным градиентом слабого раствора NaCI (0,02-0,3М) в буфере. Дело в том, что в слабых солевых растворах белки растворяются лучше, чем в воде.
Улучшение растворимости белковых молекул в элюенте способствует отрыву белков от гидрофобизированной поверхности матрицы, а следовательно, и извлечению их из неподвижной фазы.
Любопытно, что на той же самой гидрофобизированной матрице те же самые белки можно разделять обратным - снижающимся градиентом концентрации соли. В очень концентрированных водных растворах соли, в частности сульфата аммония, растворимость белков падает до нуля.
Этим можно воспользоваться для обеспечения путем элюции снижающимся градиентом сульфата аммония (например.1-0,5М) постепенного увеличения растворимости белков в элюенте, что приведет к тем же результатам, что и в предыдущем случае.
Система ХОФ-5
Другой вариант распределительной хроматографии в обращенных фазах под сокращенным наименованием ХОФ-5 (RPC-5) был одно время очень популярен и, кажется, сохранил свое значение и сейчас.
В нем используется сильно гидрофобная жидкость, тонкой пленкой надежно обволакивающая нити гидрофобизированной матрицы, например липофильной модификации сефадекса с торговым названием "Сефадекс LH-20".
Пленку образует жидкость со сложным химическим наименованием - трикаприлилмонометиламмоний хлорид (торговое название "Адоген 464"). Из ее химической формулы: видно, что молекулы этой жидкости содержат обширную алифатическую оболочку, окружающую атом азота, несущего положительный заряд.
Система ХОФ-5 оказалась весьма эффективной для фракционирования нуклеиновых кислот. Нуклеиновые основания представляют собой совокупность замкнутых циклов с сопряженными связями и потому обладают высокой степенью ароматической гидрофобности, что и обеспечивает их склонность к растворению в гидрофобной пленке.
По-видимому, такому растворению способствует и притяжение отрицательно заряженных фосфатов нуклеиновой кислоты к положительно заряженным атомам азота в адогене 464.
Элюцию колонок ХОФ-5 ведут относительно пологим возрастающим градиентом концентрации NaCl. Присутствие соли блокирует названную электростатическую связь азот-фосфор, облегчая выход ДНК из гидрофобной пленки в окружающую ее водно-солевую среду.
В качестве примера на рис.59 показан результата хроматографической очистки плазмиды pBR322 от окружающих ее в лизате бактерии РНК и высокомолекулярной ДНК (по данным фирмы BRL, 1981). Пунктирная линия на рисунке обозначает градиент концентрации NaCl.
Особенно часто обратнофазовую распределительную хроматографию используют для разделения низкомолекулярных объектов (аминокислот, пептидов, нуклеотидов и пр.) при высоком давлении (ЖХВД). Конкурентную элюцию в большинстве случает ведут градиентом относительно слабо гидрофобных органических растворителей: метанола, этанола, пропанола, ацетонитрила или тетрагидроф урана (ТГФ).
Хотя ранее было решено, что мы оставляем в стороне ЖХВД, но здесь имеет смысл о ней упомянуть, чтобы прояснить одну ранее оставшуюся без разъяснения ситуацию. Дело в том, что именно с помощью такого вида хроматографии осуществляют идентификацию аминокислот при секвенировании белков по методу Эрдмана.
Секвенирование ведется путем последовательного отщепления "сложных и весьма гидрофобных производных аминокислот". Здесь я могу привести их общее химическое наименование ("фенилтиогидантоиновые производные" - ФТГ) с одной только целью - указать на начало этого наименования, где фигурирует фенил - радикал фенола. Это и есть причина гидрофобности.
На Рис.60 показан хроматографический профиль разделения смеси ФТГ-производных 20-ти аминокислот методом ЖХВД на колонке, где на основе силикагеля закреплены алифатические 18-ти членные радикалы октилдецила. По сути дела это тот же самый первый вариант твердой гидрофобной матрицы, который
Аффинная хроматография. Общая характеристика метода
Это - самый сложный, тонкий и, пожалуй, самый капризный метод хроматографии. Но зато, в случае успеха, - фантастически эффективный! С его помощью в одной хроматографической операции удается полностью очистить вещество, представленное в смеси с другими компонентами ничтожной долей - порядка нескольких сотых процента.
Аффинный означает родственный (от латинского affinis) или, точнее, обладающий сродством. Аффинная связь в нашем случае подразумевает биоспецифическое взаимодействие, отличающееся исключительной избирательностью. Такая избирательность лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме.
В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и антителами к ним, между многими малыми молекулами, например, витаминами и специфическими транспортными белками, доставляющими их в клетку.
Наконец, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, управляющими реализацией их функций: редупликацией, транскрипцией и трансляцией.
Любой из компонентов названных и им подобных биоспецифических пар можно надежно закрепить на хроматографической матрице в качестве так называемого "лиганда". С его помощью второй партнер такой пары может быть извлечен из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами и временно задержан на матрице в составе биоспецифического (аффинного) комплекса.
После удаления всех посторонних примесей промывкой тем же элюентом, в котором осуществлялось образование этого комплекса, можно произвести замену элюента на такой, который нарушит биоспецифическую связь лиганда с его аффинным партнером. Это обеспечит быстрый выход последнего из колонки, на которой останется освобожденный для новых аффинных связей лиганд.
Биоспецифическое взаимодействие реализуется за счет тех же, хорошо знакомых нам сил связи, которые фигурировали в рассмотренных ранее видах хроматографии: электростатического притяжения разноименных ионов, водородных связей и сил гидрофобного взаимодействия.