Реферат: Вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин на патогенез експериментального цукрового діабету

Отримані результати впроваджені у навчальний процес кафедр патофізіології Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, Запорізького державного медичного університету, Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, кафедри фізіології Буковинського державного медичного університету, кафедри фармакології Харківського медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведені наступні види робіт: патентний та інформаційний пошук, виконання експериментальних досліджень, збір матеріалу для подальшого аналізу, морфометричне дослідження стану острівкового апарату підшлункової залози, статистичний аналіз одержаних даних біохімічних, морфологічних і морфометричних методів дослідження, оформлення наукових статей до друку, що відображають основні наукові положення дослідження, написання всіх розділів дисертаційної роботи, представлення результатів дослідження на наукових з’їздах і конференціях.

Сумісно із науковим керівником здійснено вибір теми дисертаційної роботи, постановка мети і завдань дослідження, планування експерименту, інтерпретація одержаних результатів і формулювання висновків.

У роботах, виконаних у співавторстві, реалізовані наукові ідеї здобувачки. Співавторами здійснювалося допомога у виконанні біохімічних, морфологічних і морфометричних методів дослідження, консультація щодо статистичної обробки результатів дослідження та їх інтерпретації. Дисертантом не були використані результати та ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення та висновки дисертаційної роботи доповіданні і обговорювані на: науковій конференції “IV читання ім. В.В. Підвисоцького” (м. Одеса, 26-28 травня 2005 р.), II Міжнародній науково-практичній конференції “Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка” (м. Одеса, 8-9 вересня 2005 р.), XVII з’їзді Українського фізіологічного товариства (м. Чернівці, 18-20 травня 2006 р.), науковій конференції “Актуальні питання патофізіології” (мм. Симферополь-Ялта, 5-6 жовтня 2006 р.), IX Українському біохімічному з’їзді (м. Харків, 24-27 жовтня 2006 р.), VII з’їзді асоціації ендокринологів України (м. Київ, 15-18 травня 2007 р.), Науковій конференції “VI читання ім. В.В. Підвисоцького” (м. Одеса, 31 травня – 1 червня 2007 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в 13 наукових працях, з них 6 – у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 1 – стаття у збірнику, 6 – у матеріалах конференцій.

Структура дисертації. Робота викладена на 158 сторінках, з них на 19 сторінках наведено 15 таблиць і 47 рисунків. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків і переліку використаних літературних джерел. Перелік містить 172 джерела, з них 52 – вітчизняної та 120 – іноземної літератури.

Основний зміст

Матеріал і методи дослідження. Експеримент проводили на 85 лабораторних білих щурах (самцях). Середня маса тварин перед початком експерименту становила 235,4±24,5 г. Контрольну групу склали 10 тварин, які утримувалися в тих же умовах, що й тварини експериментальних груп.

Цукровий діабет моделювали на 75 тваринах шляхом внутрішньочеревного введення водного розчину алоксану (Fluka, Німеччина) в дозі 200 мг/кг. Після введення алоксану у 3 (4,0%) тварин розвинувся вкрай тяжкий стан із гіперглікемією вище 30 ммоль/л, тому вони були виведені із експерименту на 3-4 добу. На 30 добу після розвитку в щурів цукрового діабету для подальшого експерименту було відібрано 65 щурів зі станом середньої тяжкості (з рівнем глюкози крові натще від 8 до 16 ммоль/л). З них 3 тварини виведені з експерименту для одержання даних про зміни у структурі підшлункової залози перед трансплантацією (контроль моделі).

Тварини були поділені на 4 експериментальні групи. Тваринам 1 групи (14 щурів) трансплантацію клітинних культур не проводили, на 30 добу експерименту їм внутрішньочеревно вводили 1 мл стерильного фізіологічного розчину натрію хлориду. Тваринам 2 групи (24 щура) на 30 добу вводили внутрішньочеревно культуру острівкових клітин підшлункової залози (ПШЗ). На 38 добу 12 тваринам цієї групи повторно ввели аналогічну культуру (група 2Б), тварини, що залишися, склали групу 2А. Тваринам 3 групи (12 щурів) на 30 добу експерименту вводили внутрішньочеревно зруйновану шляхом дворазового циклу заморожування-розморожування культуру острівкових клітин ПШЗ. Тваринам 4 групи (12 щурів) на 30 добу однократно внутрішньочеревно вводили культуру гемопоетичних стовбурових клітин. Для отримання проміжних морфометричних результатів на 45 добу експерименту по 3 тварини з кожної групи виводили з експерименту. Всі інші тварини були виведені з експерименту на 70 добу. В усі терміни тварин виводили з експерименту шляхом декапітації під загальною анестезією кетаміном в дозі 75 мг/кг.

Культури алогенних гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК) і ксеногенних кролячих ендокринних клітин підшлункової залози були отримані у лабораторії клітинного та тканинного культивування Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К.Гусака АМН України. Приготування культури алогенних ГСК включало наступні етапи: вилучення ембріонів 14 днів гестації, вилучення ембріональної печінки, механічну дезагрегацію та фільтрацію через декілька фільтрів, висів на культуральні флакони з поживним ростовим середовищем DMEM/F12, культивування протягом 1 години при 37°С, відбір надосадової рідини із клітинами, що не прикріпилися до флакону. Гемопоетична популяція клітин залишалася у надосадній рідині через свої неадгезивні (субстрат-незалежні) властивості. Отриману суспензію розділяли на порції об’ємом 0,3 мл і терміново вводили щурам-реципієнтам. Для детекції ГСК використовували імунотипування клітин на проточному цитометрі FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Було встановлено, що клітинна суспензія ембріональної печінки містила 61 млн. клітин, які містили ядро, на 1 мл, серед яких CD90(Thy-1.1)+/CD3–/CD45RC– клітини склали 0,27% (за свідченням багатьох авторів (Castagnola C. et al., 1982, McCarthy K.F. et al., 1987), саме ця популяція клітин щурів містить велику кількість ГСК), тобто у одній трансплантаційній порції містилося біля 50 тис. ГСК.

Культуру острівкових клітин кроля отримували за наступною схемою (Шумаков В.И. и др., 1995): видалення у кроля віком 2 тижні підшлункової залози, пунктирування протоку із введенням 0,25% розчину трипсину, механічна дезагрегація і глибока трипсинізація, центрифугування. Після видалення супернатанту у клітинний осад додавали поживне середовище Ігла. Життєздатність клітин перевіряли у камері Горяєва із одномоментним підрахунком їх кількості. Концентрація життєздатних клітин в 1 мл суспензії становила 2,5 млн/мл. Далі первинну суспензію розводили та розділяли на порції по 0,3 мл, кожна з котрих містила 50 тис. клітин. Культуру терміново вводили щурам-реципієнтам. Встановлено, що культура острівкових клітин ПШЗ містила 73,7% бета-клітин, 20,6% – альфа-клітин і 5,7% інших клітин.

Визначення рівня глюкози, ТГ, ЗХ і холестерину ЛПНЩ і ЛПВЩ проводили на напівавтоматичних біохімічних аналізаторах. Індекс атерогенності (ІА) розраховували за стандартною формулою: ІА=(ЗХ–ЛПВЩ)/ЛПВЩ. Вміст інсуліну визначали за допомогою імуноферментного аналізу.

Морфологічне і морфометричне дослідження проведене у лабораторії фундаментальних досліджень Інституту невідкладної і відновної хірургії ім.. В.К.Гусака АМН України. З видалених тканин виготовляли забарвлені гематоксиліном та еозином препарати за стандартною методикою (Меркулов Г.А.., 1969). При імуногістохімічному забарвленні використовували первинні антитіла проти інсуліну (поліклональні, мурчакові), глюкагону (поліклональні, кролячі) та ядерного антигену клітин, що проліферують, – PCNA (моноклональні, клон PC10). Первинні антитіла виявляли за допомогою системи візуалізації “LSAB 2 for rat” (всі реактиви фірми DAKO, Данія).

Для підтвердження припущень щодо механізму впливу клітинних культур на острівковий апарат ПШЗ було виконано потрійне імунофлюоресцентне фарбування тканини залози у 3 тварин кожної групи на 45 та 70 добу експерименту.. Для цього використовували антитіла проти інсуліну, PCNA, а також DAPI в якості ядерного барвника. Первинні антитіла виявляли за допомогою вторинних із флуоресцентними мітками таким чином, щоб ядра клітин, що діляться, забарвлювались у червоний колір, інших клітин – у синій, цитоплазма інсулін-позитивних клітин – у зелений колір.

Дослідження препаратів здійснювали на мікроскопі Axiostar (Carl Zeiss, Німеччина). Мікрофотографування проводили на дослідницькому мікроскопі Olympus AX70 (Японія) цифровою камерою Olympus DP50, морфометрічне дослідження – з використанням програми AnalySIS Pro 3.2 (фірма SoftImaging, Німеччина).

Морфометричне дослідження стану острівкового апарату проводили на забарвлених імуногістохімічно препаратах. Підраховували загальну кількість клітин в острівцях, кількість клітин, в ядрах яких експресується PCNA-антиген (клітини, що знаходяться у процесі поділу), кількість клітин, що містять у цитоплазмі інсулін і глюкагон, виміряли розмір кожного острівця. Для вивчення мікроангіопатії було обрано серце. Під час морфометричного дослідження судин серця вимірювали мінімальний внутрішній і зовнішній діаметри певної судини і вираховували радіус, абсолютну та відносну товщину стінки судини. Оскільки діаметр вивчених судин коливався від 10 до 150 мкм, то вони було розподілені на три групи: а) дрібні артерії з діаметром від 75 до 150 мкм; б) артеріоли з діаметром від 25 до 75 мкм; в) прекапілярні артеріоли з діаметром менше 25 мкм.

Статистичну обробку проводили за допомогою програми статистичного аналізу Primer of Biostatistics 4.03 (США) і Statistica 6.0 (StatSoft, США). Розбіжності між групами розраховувалися із використанням непараметричного критерію Крускала-Уолліса. Зв'язок між параметрами оцінювали за допомогою коефіцієнту рангової кореляції Спірмена.

Результати досліджень. Після введення алоксану через 30 діб у тварин розвивалася типова картина інсулін-залежного цукрового діабету із підвищенням середнього рівня глюкози до 12,52±2,02 ммоль/л (табл.1), що в 2,9 рази вище в порівнянні з контролем (p<0,05). Ці зміни обумовлені масовою загибеллю клітин, що синтезують інсулін. Так, при морфометричному аналізі ПШЗ було встановлено, що середня кількість острівців на 10 мм² зрізу зменшилась у 5,3 разів (p<0,05) (табл.2,3), а ті, що залишилися, стали маленькими, в 1,7 рази менше, ніж у нормі (p<0,05), що призвело до зменшення питомого об’єму острівкової тканини в 9,3 разів (p<0,05). У складі острівців, що збереглися, було лише 34,0±2,7% бета-клітин. Це знайшло відображення у зниженні кількості ІСК на одиницю площі в 20 разів (p<0,05). Також встановлено, що деякі ацинарні клітини набули здатність до секреції інсуліну. Такої трансформації найчастіше піддавалися або всі, або більшість клітин у певному ацинусі, тому всі групи мали округлу форму з наявністю невеликого просвіту в центрі, тобто мали морфологію екзокринного ацинуса. Також були виявлені поодинокі інсулін-позитивні клітини серед протокових епітеліоцитів. Результатом зниження кількості клітин, що синтезують інсулін (ІСК), у залозі стало зниження рівня інсуліну крові у 51,5 разів (p<0,05). Але було встановлено прискорення ділення клітин у збережених острівцях в 6,0 разів у порівнянні із нормою (p<0,05). Порушення обміну вуглеводів призводить і до порушень жирового обміну, бо жири стають основним джерелом енергоутворення у багатьох клітинах. Так, спостерігали збільшення рівня ТГ в 2,6 рази (p<0,05) (табл.4), ЗХ – в 1,6 рази (p<0,05), холестерину ЛПНЩ – в 2,1 рази (p<0,05), зниження рівня холестерину ЛПВЩ в 1,8 рази (p<0,05). ІА збільшився в 4,5 разів у порівнянні з інтактними тваринами і перевищив критичне значення (5,69±1,36 при нормі не більше 3,0). Дані зміни на 30 добу експериментального ЦД вказують на розвиток на даний термін типової картини діабетичної дисліпідемії. Надмірна глікемія із порушеннями ліпідного обміну є причинами розвитку мікроангіопатії. При гістологічному дослідженні судин серця було виявлено потовщення стінки прекапілярних артеріол, у дрібних артеріях спостерігали ознаки плазматичного просочування. Середня товщина стінки прекапілярних артеріол збільшилась у 1,4 рази (p<0,05) (табл.5), а відносна товщина – у 1,3 рази (p<0,01) (табл.6). Найбільш виразним було потовщення стінок артеріол – абсолютної товщини у 1,6 рази (p<0,001), відносної – у 1,4 рази (p<0,001). Потовщення стінок дрібних артерій було також відчутним – абсолютної товщини – у 1,3 рази (p<0,001), відносної – у 1,4 рази (p<0,001).

Надалі (на 45 і 70 доби експерименту) спостерігали ознаки регенерації острівкової тканини. І хоча кількість острівців на одиницю площі не змінилася, у самих острівцях залишався високим процент клітин, що проліферують (табл.2,3), він був менший ніж на 30 добу, але значно вищий (в 4,3 рази на 45 добу і в 3,1 рази на 70 добу), ніж в інтактних тварин. Але прискорення проліферації клітин не відобразилося на питомому об’ємі острівкової тканини. Істотні зміни відбувалися у клітинному складі острівців. Якщо на 30 добу відносна кількість бета-клітин дорівнювала 34,0±2,7%, то на 45 добу вона вже була на рівні 45,9±3,8% (p<0,05), а на 70 добу – 60,2±3,9% (p<0,05). Тобто в острівцях відбувалося зменшення відсотку альфа-клітин, місце яких займали бета-клітини. Це призвело до зростання середньої кількості ІСК на одиницю площі залози в 1,3 рази (p<0,05) на 45 добу і в 1,9 рази (p<0,05) на 70 добу. Майже у стільки ж разів підвищився і рівень інсуліну в крові на 70 добу – в 2,0 рази. Результатом цього стало зменшення гіперглікемії на 45 добу у 1,1 рази (p<0,001) у порівнянні з 30 добою, та у 1,3 рази (p<0,001) на 70 добу, але цей рівень був набагато більше рівня глюкози у інтактних тварин – в 2,2 рази (p<0,001). При дослідженні показників жирового обміну встановлено достовірне збільшення рівня ТГ (в 2,7 рази, p<0,001), ЗХ (в 1,6 рази, p<0,001) і холестерину ЛПНЩ (в 1,9 рази, p<0,001), зниження рівня ЛПВЩ (в 1,6 рази, p<0,01). ІА був вище в 4,1 разів (p<0,001) ніж в інтактних тварин. Ступінь дисліпідемії практично не змінився, достовірної різниці між відповідними показниками не було. Тривала гіперглікемія і дисліпідемія призвели до прогресування мікроангіопатії: спостерігали різке потовщення стінки артерій усіх калібрів, стінки артеріол і дрібних артерій гіалінізовані. Збільшення абсолютної і відносної товщини стінки судин різного калібру склало від 1,9 до 2,3 рази у порівнянні із інтактними щурами (для всіх судин p<0,001). При порівнянні даних на 30 і 70 добу наявною є значна прогресія мікроангіопатії – відносна товщина судин достовірно зросла у 1,3-1,4 рази (p<0,01). Таким чином, незважаючи на деяке покращання показників вуглеводного обміну, наявною була прогресія мікроангіопатії.

Таблиця 1

Показники обміну вуглеводів у тварин різних експериментальних груп на 70 добу експерименту

Група тварин	Глюкоза, ммоль/л	Інсулін, мкг/л
Контрольна (інтактні тварини)	4,31±0,48	1,03±0,25
Тварини на 30 добу експерименту	12,94±1,47	0,02±0,01
1 група	9,68±1,23	0,04±0,02
2А група	6,65±0,61##	0,24±0,08##
2Б група	6,14±1,11##	0,43±0,09##
3 група	7,68±1,78#	0,14±0,05##
4 група	5,82±0,80##	0,63±0,14##

Примітки: 1. Відмінності всіх показників у всіх експериментальних групах із відповідними показниками інтактних тварин достовірні при p<0,001, із показниками тварин, яких вивели з експерименту на 30 добу при p<0,05.

2.Вірогідність відмінностей показників із 1 групою тварин: # – p<0,05, ## – p<0,001.

Таблиця 2

Провідні морфометричні показники підшлункової залози у щурів різних груп на 45 добу експерименту

Показник	Інтактні тварини (n=10)	На 30 добу експери-менту (n=3)	На 45 добу експерименту
			1 група (n=3)	2А група (n=3)	2Б група (n=3)	3 група (n=3)	4 група (n=3)
Клітини, що проліферують, %	1,04±0,14	6,20±2,07†	4,44±0,62†	16,73±3,67† , § ,*	21,79±2,19† , § ,*	15,42±1,09† , § ,*	44,13±4,85† , § ,*
Питомий об’єм острівкової тканини, %	0,93±0,10	0,10±0,01†	0,10±0,01†	0,18±0,03† , § ,*	0,22±0,33† , § ,*	0,14±0,02† , § ,*	0,31±0,04† , § ,*
Середня кількість острівців на 10 мм2	11,70±1,62	2,21±0,37†	1,99±0,14†	4,00±0,51† , § ,*	4,14±0,32† , § ,*	3,70±0,16† , § ,*	4,11±0,23† , § ,*
Середня кількість ІСК на 1 мм2	69,03±8,50	3,37±0,10†	4,82±1,56†	7,03±1,08† , §	8,48±0,52† , § ,*	5,89±0,23† , §	11,02±1,77† , § ,*
Середня площа острівця, мкм2	8110,6±1056,6	4803,1±652,1†	5554,6±604,6†	5992,6±953,4†	7435,6±614,8§ ,*	4271,8±337,9† ,*	6178,0±482,3† , §
Інсулін-позитивні клітини, %	77,5±2,1	34,0±2,7†	45,9±3,8† , §	32,4±5,5† ,*	34,1±2,5† ,*	40,4±2,7† , §	22,1±2,6† , § ,*
Глюкагон-позитивні клітини, %	21,9±2,1	58,6±1,2†	49,7±2,8† , §	60,1±4,5† ,*	52,1±5,0† , §	51,3±0,9† , §	31,5±1,1† , § ,*
Інсулін- і глюкагон-негативні клітини, %	0,54±0,20	7,35±1,56†	7,09±1,01†	7,38±1,21†	13,66±2,67† , § ,*	8,22±3,30†	46,09±3,32† , § ,*
Відношення інсулін+ до глюкагон+ клітин	3,57±0,39	0,58±0,06†	0,93±0,13† , §	0,55±0,13† ,*	0,66±0,11† ,*	0,79±0,05† , § ,*	0,70±0,07† , § ,*
Середня кількість кластерів інсулін-позитивних ацинарних клітин на 10 мм2	-	2,96±0,59	3,15±0,58	3,07±0,47	3,54±0,23	3,65±0,45	3,41±0,28
Середня кількість клітин в кластері	-	4,42±0,51	4,68±0,40	4,25±0,53	4,15±0,59	4,23±0,34	4,34±0,70