Реферат: Выделение и очистка белков сухожилий
После секреции в межклеточное пространство и отщепления, пропептидов молекулы коллагена агрегируют в фибриллы, являющиеся первичной формой надмолекулярной структуры коллагена. Поскольку молекулярный механизм фибриллообразования в Организме мало доступен для изучения, основные гипотезы получены на основании исследования агрегации молекул при осаждении их из растворов коллагена.
Типы растворимого коллагена можно разделить на две основные категории. К первой категории (нативные растворы) относятся растворимые фракции, получаемые прямой экстракцией из соединительной ткани молодых животных, у которых коллаген еще недостаточно скреплен межмолекулярными связями. Различаются кислоторастворимый и нейтральносолерастворимый коллаген, экстрагируемые соответственно кислыми буферами и нейтральными солевыми растворами. Ко второй категории относятся растворы зрелого, нерастворимого коллагена, полученные после предварительной ферментативной, химической или механической обработки ткани (солюбилизированный коллаген). Эта категория растворов была использована нами для создания лечебных препаратов из коллагена.
В зависимости от условий осаждения (рН, ионная сила, температура и др.) из раствора коллагена можно получить различные типы фибриллярных структур:
1) фибриллы с неупорядоченной структурой без периодичности;
2) кристаллы длиной 280 нм (SLS‑сегменты), представляющие собой параллельную агрегацию молекул бок в бок. В SLS определили 117 поперечных асимметричных полос, которые, подобно «отпечатку пальцев», характеризуют распределение полярных и неполярных аминокислотных остатков;
3) фибриллы FLS с периодом 280 нм, в которых молекулы также агрегируют параллельно, но ориентированы в соседних слоях в разные стороны (опозиционно), так что N‑концы соединены с С-концами; Рис. 27. Возможные пути внутриклеточного транспорта и секреции коллагена.
4) фибриллы нативного типа (т.е. соответствующие тканевым) с периодичностью 64–67 нм. Основной период в этих фибриллах состоит из светлой А-зоны и темной В-зоны, особенно отчетливо видимыми при негативной окраске фосфорно-вольфрамовой кислотой. После позитивного контрастирования в периоде обнаруживается 12 темных и 12 светлых дополнительных полос, отражающих первичную структуру молекулы [Kuhn К., 1974].
Для изучения фибриллогенеза в организме наибольшее значение имеет механизм агрегации молекул в фибриллы нативного типа, объясняющий наличие периодичности. Начиная с 50‑х годов был выдвинут ряд различных гипотез, из которых наибольшее значение имела модель сдвига соседних молекул на четверть своей длины [SchmittF. О., GrossJ., 1955], и модель R.A. Grant и соавт. (1967), по которой периодичность объясняется существованием на молекулах «полос связывания» длиной 26,5 нм, содержащими полярные группы, и полос, содержащих неполярные группы 37,5 нм.
Позже было установлено, что длина молекулы кратна не 4, а 4,4D (D– длина периода 64 нм). Молекулы, упакованные в фибриллу, в линейной проекции разделены промежутком 0,6 D (зона «пустоты»), а соседние параллельные ряды молекул сдвинуты относительно друг друга на величину периода D, причем они перекрывают концы параллельных им молекул на 0,4 D (зона «перекрытий»).
Таким образом, вдоль фибриллы чередуются зоны «пустот» и «перекрытий», которые на негативно окрашенных электронограммах отражаются соответственно в темных и светлых полосах периода [Ktihn К., 1969; BrunsR. R., GrossJ., 1974; MillerA., 1976]. Вся структура стабилизована за счет поперечных связей между молекулами.
Описанная картина укладывается в двухмерную модель упаковки молекул коллагена, изучение же трехмерной структуры сопряжено со значительными трудностями. Одной из наиболее признанных является модель J.W. Smith (1968), по которой пять молекул, сдвинутых между собой на ID, соприкасаясь боковыми поверхностями, уложены в цилиндрический филамент, причем пятая молекула сдвинута по отношению к первой на 4D. Такой филамент растет в длину за счет присоединения новых молекул, а в ширину фибрилла растет только путем соединения филаментов между собой. Внутри филамента молекулы свернуты в спираль [PiezК.А., 1975]. Близка к этому и модель A. Veis н соавт. (1967), в которой предусматривается, что филаменты состоят из четырех молекул коллагена. Следует отметить, что диаметр филаментов по этим моделям (3,5 нм в сухом и 5 нм во влажном состоянии) совпадает с размерами минимальных филаментов (прото- или микрофибрилл), обнаруженных внутри тканевых коллагеновых фибрилл [Olsen В. R., 1963; DoyleВ.В. etal., 1974; Brims R.R., 1976], а также в поперечно исчерченных филдментарных агрегатах (см. раздел 2.2.6).
По данным М. Bouteille, D. С. Pease (1971), J.H. Lillie и соавт. (1977), при «инертной» дегидратации, воздействии мочевины или гуанидинхлорида происходит диссоциация фибрилл на филаменты толщиной 3,5–4 нм, причем выявляется спиралевидное скручивание этих филаментов. Спиральная структура коллагеновых фибрилл обнаруживается также при применении метода замораживания – раскалывания [RaynsR. etal., 1974; BeltonJ. С. etal., 1975], вероятно, в результате использования агентов, разрушающих водородные связи. В некоторых случаях спиралевидная структура фибрилл отмечается и при обычной заливке, например в опухолях [Manabe Т., KajikkawaV., 1976]. Подобные изменения были обнаружены в склере при резко выраженной близорукости.
В заключение следует отметить, что пока не существует общепризнанной модели трехмерной структуры фибриллы, которая полностью отвечала бы рентгеноструктурным и электронно-микроскопическим данным. Обсуждаются возможности тетрагональной и гексогональной решетки, цилиндрической (в форме вставленных друг в друга цилиндров из слоев молекул) и спиральной (закрученной в рулон) упаковки молекул в фибриллу [MillerA., 1976].
1.3 Данные ЯМР о структуре связанной воды в коллагене с помощью сканирующей калориметрии
В состав нативного (неповрежденного) коллагена входит связанная вода, составляющая около 2/3 (или ∼66%) от полной массы сухожилия. Установлено, что вода играет существенную роль в механизме самосборки молекул коллагена и образования фибрилл в цитоплазме коллагеноцитов, а также в механизмах биохимической активности и функционировании коллагена во внеклеточном пространстве живого организма [1]. Однако до настоящего времени принципиальный характер гидратной структуры коллагена остается невыясненным. По данным 2 Н ЯМР спектроскопии сухожилий хвоста крысы, обогащенной тяжеловодородной водой 2 H2 O, было установлено, что в ″плотных″ участках структуры коллагена молекулы связанной воды (2 Н2 О) характеризуются константами квадрупольного взаимодействия (ККВ) ядер 2 Н ~3 кГц (в интервале от +20° до ∼+5 °C).
При отрицательных температурах ККВ возрастают, достигая значений ~8 кГц при –10 °C, и тенденция к увеличению ККВ сохраняется при дальнейшем понижении температуры. Относительно малая величина ККВ и ее плавные изменения типичны для процессов диффузионной подвижности молекул воды в нанопористых системах цеолитового типа. Фазовые переходы в подобных системах, как правило, являются переходами типа порядок–беспорядок (близкими к фазовым переходам второго рода) и не сопровождаются резкими тепловыми эффектами.
В то же время по данным 2 Н ЯМР водная подсистема коллагена в областях ″щелей″ характеризуется очень малыми значениями ККВ (близкими к нулевым), что указывает на сильную раз-упорядоченность подсистемы связанной воды в ″рыхлых″ участках структуры коллагена. Обнаружено также, что в окрестности температуры замерзания воды (∼273 K) скачкообразным образом изменяется спектр 2 Н ЯМР сухожилия. Интенсивная центральная линия, относимая нами к рыхлым участкам структуры коллагена, становится ненаблюдаемой, что может указывать на фазовый переход первого рода. Данный факт косвенно свидетельствует в пользу модели, в соответствии с которой ″рыхлые″ участки структуры коллагена представляют собой тектогидрат, или структуру, включающую непрерывный трехмерный каркас из молекул воды с тетраэдрической координацией, характерной для льда и клатратных гидратов. В этом случае значение ККВ и ширина спектра 2 Н ЯМР должны возрастать на два порядка по сравнению с комнатной температурой, соответственно амплитуда сигнала должна упасть на два порядка, что согласуется с экспериментом. Однако для прямого подтверждения подобной модели расположения молекул воды необходимо получить термодинамические характеристики данного фазового перехода.
В данной работе был проведен анализ величины скрытой теплоты фазового перехода в сухожилиях хвоста крысы с использованием метода сканирующей калориметрии. Для исследований были взяты образцы сухожилия RTT экспериментальных животных линии ″Вистар″, содержавшихся на стандартном питании. Возраст крыс составлял 6 месяцев, численность в группе – 3 животных. Образцы волокон сухожилий весом 100–150 мг изымали непосредственно перед исследованием. Измерения проводили в интервале от комнатной температуры (+20 °С) до –30 °С, скорость изменения температуры 3 град./мин. при использовании автоматического калориметра ДСК‑204 фирмы Netzsch (Германия). Результаты измерений представлены в таблице.
Полученные данные можно сравнить со справочными параметрами для скрытой теплоты плавления чистого льда: Qпл (лед) = 333,5 Дж/г [6]. При сравнении следует учитывать, что в сухожилиях содержание коллагена достигает 94%, а содержание воды в нативном коллагене составляет ∼66%. Распределение связанной воды между плотными и рыхлыми участками достоверно не установлено, но по данным ЯМР 2 Н [5] в ″рыхлых″ участках коллагена содержится примерно половина общего содержания воды в сухожилии. Таким образом, если структура подсистемы молекул воды в вакансионных участках нативного коллагена при отрицательных температурах соответствует структуре тектогидрата (клатратоподобного или льдоподобного типа), то ожидаемая скрытая теплота фазового перехода в данной подсистеме должна составить
Qпер = ~(0,66⋅0,5⋅0,94)⋅Qпл (лед) = ∼94 Дж/г,
что находится в хорошем согласии с измеренными значениями для трех образцов.
На кривых охлаждения наблюдаются пониженные значения Qпер , что является следствием значительного переохлаждения образцов при понижении температуры. Данный эффект позволяет получить оценочное значение теплоемкости cp высокотемпературной фазы подсистемы молекул воды, испытывающей фазовый переход. В рамках обсуждаемой модели среднее значение величины изменения теплоты фазового перехода ΔQпep = 16,55 ± 3,9 Дж/г должно быть связано со средней величиной температуры переохлаждения ΔТ = (11,5 ± 0,7)° соотношением
ΔQпep = ~(0,6⋅0,5⋅0,94)⋅Δср ΔT,
где Δср – разность между теплоемкостью воды и льда. Если свойства водной подсистемы, испытывающей фазовый переход в коллагене, соответствуют свойствам свободной воды и льда, то Δср = 2,062 Дж/г (вблизи 0 °С [6]). Отсюда рассчитанная величина ΔQпер = ∼6,69 Дж/моль; пониженное по сравнению с экспериментом значение расчетной величины ΔQпер может указывать на существование вклада в Δср , связанного с взаимодействием молекул воды и функциональных группировок в белковой структуре. Таким образом, на качественном уровне величина скрытой теплоты фазового перехода находится в согласии с моделью, согласно которой свойства примерно половины связанной воды в структуре коллагена близки к свойствам свободной (или объемной) воды. Повышенные температура плавления льда связанной воды в коллагене и разница значений теплоемкости Δср могут указывать на некоторую взаимосогласованность структур воды и фибриллярного белка, возможно, клатратного типа.
2. Способы иммобилизации коллагена из различных органов и тканей. Возможность применения в иммобилизации коллагенов сухожилий
Для растворения коллагена используются различные методики, но большинство из них основано на растворении в уксусной кислоте.
Энуклеированные замороженные глазные яблоки свиньи (–20°) размораживают при комнатной температуре, склера отделяется от остатков мышц, связок и пигмента и промыта холодной водой. Полученная ткань может храниться в замороженном виде в течение 3–4 недель. Выделение коллагена. 100 г. очищенной склеры заливается 5 л щелочного раствора (66 г. NaOH + 100 г. Na2 SO4 на 1 л раствора) и при периодическом перемешивании выдерживается при 20° в течение 36 ч. При этом полисахариды и протеогликаны, составляющие значительную часть склеры, переходят в раствор. Затем склеру отделяют от раствора на воронке Бюхнера и промывали 10 л дистиллированной воды. Для нейтрализации щелочи ткань обрабатывают 2%-м H3 BO3 в течение 40 мин при перемешивании на магнитной мешалке. Обработку склеры раствором борной кислоты повторяют 4 раза до установления pH раствора 6.0. После нейтрализации щелочи склеру 4 раза отмывают от H3 BO3 и Na2 SO4 дистиллированной водой (5 л), каждый раз в течение 40 мин при 20° при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Степень отмывки определяют по полному удалению (SO4 ) – (реакция с BaCl2 ). Получение раствора коллагена. К отмытой склере добавляют равное по объему количество 0.3 MCH3 COOH и выдерживают полученную гелеобразную полупрозрачную массу в течение 7–8 сут при 4° и слабом перемешивании. В этих условиях коллаген переходит в раствор, и склера растворяется практически без остатка. Полученный раствор гомогенизируют и фильтруют через стеклянный фильтр с размером пор 160 мкм, используя водоструйный насос. Концентрация коллагена в полученном растворе (по сухому остатку) составляет 2% по массе. Часть полученного раствора разбавляли 0.2 М Na‑ацетатным буфером с pH 3.44 до концентрации 8.6⋅10–6 и 8.6⋅10–7 М.
Определение концентрации. Содержание коллагена в пробах определяют модифицированным методом Лоури [18] при помощи реактива Фолина–Чиокалто. В качестве стандарта используют раствор желатины известной концентрации. Регистрацию проводят спектрофотометрически при λ = 750 нм. Реакционная смесь состоит из 0.04 М CuSO4 , 0.11 М Na2 C4 H4 O6 , 0.05М Na2 CO3 , 0.4 М NaOH, реактива Фолина–Чиокалто и коллагенового раствора. Метод основан на регистрации окрашенного соединения, образующегося при взаимодействии белка с реактивом Фолина [19].
Известен способ получения коллагена по патенту США 5106949, МПК A 61 K 35/32, опубл. 21.04.1992 г. Согласно патенту коллаген получают из сухожилий (предпочтительно сухожилий сгибателя копыта телят). Далее производят следующие операции: