Статья: Андрогенез у рыб, или Только из мужского семени
Чтобы подтвердить наследование гибридами ядерной ДНК от отцовского вида, а митохондриальной от материнского, В.А.Барминцевым с сотрудниками (сектор молекулярной генетики гидробионтов, ВНИРО) был проведен молекулярно-генетический анализ. Как и должно быть, при осеменении севрюжьих яйцеклеток с “убитым” ядром спермой белуги у потомства ядерная ДНК принадлежала белуге, а митохондриальная ДНК, локализованная в цитоплазме и наследуемая по материнской линии, - севрюге. Кроме того, молекулярными методами был подтвержден и диспермный характер происхождения гибридов [6].
Мы получили жизнеспособных андрогенетических гибридов не только от родительской пары “севрюга белуга”, но и от других видов (с одинаковой плоидностью) осетровых рыб (см. табл.1). Для некоторых из этих гибридов Е.Д.Васильевой (биологический факультет МГУ) был выполнен детальный морфологический анализ. Судя по его результатам, к годовалому возрасту гибриды полностью идентичны по морфологическим признакам отцовскому виду [6].
В ходе экспериментов выяснилось, что не все пары видов с равным числом хромосом могут давать жизнеспособных гибридов. Так, на ранних стадиях останавливалось развитие зародышей от филогенетически близких севрюги и стерляди (A.ruthenus), белуги и шипа (A.nudiventris). Значит, помимо различий в плоидности существуют и другие, пока еще не изученные факторы несовместимости.
Преодолеть ядерно-цитоплазматическую несовместимость мы попытались обходным путем: для андрогенеза использовали яйцеклетки не чистых видов, а обычных межвидовых гибридов и сперму одного из родительских видов [10].
Схема получения андрогенетических межвидовых гибридов с применением гибридной цитоплазмы.
В опыте использованы цветные самцы карпа кои, маркированные рецессивными генами окраски, и серые самки дикого типа, доминантные по соответствующему признаку. Проявление у потомства окрашивания по отцовскому типу надежно подтверждает инактивацию женских ядер и индукцию андрогенетического развития.
Эффективность такого способа мы проверили в экспериментах на костистых рыбах. Оплодотворив спермиями карпа генетически инактивированные яйцеклетки гибридов от скрещивания серебряного карася с карпом и удвоив мужской хромосомный набор (блокированием первого деления дробления), получили жизнеспособных андрогенетических гибридов [10]. Возникшие из гибридных яйцеклеток, они развивались нормально, поскольку отцовское ядро попало в цитоплазму, наполовину состоящую из белков собственного вида. Кстати отметим: прямые андрогенетические гибриды от “скрещивания” облученных яйцеклеток серебряного карася и спермиев карпа, были нежизнеспособны [2].
Все тот же обходной маневр проверен нами и на осетровых рыбах: белуге, стерляди и их плодовитом гибриде - бестере. Но теперь использовались не гибридные яйцеклетки, а гибридная сперма. Надо сказать, из своих опытов мы уже знали, что от “скрещивания” стерляди с белугой выживаемость андрогенетических межвидовых гибридов на эмбриональных стадиях ниже, чем у эмбрионов от внутривидового андрогенеза у стерляди. Когда вместо спермиев белуги использовались спермии бестера, выживаемость андрогенетических зародышей значительно повысилась.
С криоконсервированной спермой
Научившись получать андрогенетических гибридов за счет слияния нативных спермиев, мы попытались использовать вместо них криоконсервированную сперму * [11]. Сложность была в том, что такая сперма обычно уже наполовину разведена растворами криозащитных сред, а наш метод диспермного андрогенеза требует концентрированной спермы. Кроме того, спермии после замораживания и последующего оттаивания могут терять подвижность, из-за чего снижается их оплодотворяющая способность.
* В этой работе участвует также группа криобиологов под руководством Л.И.Цветковой (лаборатория криобиологии Всероссийского НИИ пресноводного рыбного хозяйства).
Тем не менее нам удалось модифицировать методику осеменения облученных яйцеклеток криоконсервированной спермой и осуществить диспермный андрогенез у севрюги (табл.2). Правда, и оплодотворяющая способность замороженной спермы, и выживаемость андрогенетических зародышей оказались ниже, чем в вариантах с использованием нативной спермы. Что касается выживаемости зародышей, то ее низкий уровень, видимо, обусловлен возникновением в спермиях доминантных и (или) рецессивных леталей вследствие заморозки. Мы проследили за развитием выживших андрогенетических севрюжек примерно до трехнедельного возраста и заметили, что их гибель снижалась по мере роста. Таким образом, из криоконсервированной спермы опытным путем был воссоздан генотип азовской севрюги, запасы которой в настоящее время подорваны.
Итак, осуществлен диспермный андрогенез у осетровых рыб с использованием глубокозамороженной спермы. Это подтверждает пригодность метода для воссоздания геномов тех видов, от которых сохранилась только такая сперма.
С помощью андрогенеза с применением криоконсервированной спермы мы также оцениваем качество технологий ее замораживания [11]. С этой целью изучаем выживаемость гаплоидных зародышей. У них воспроизводится геном спермиев и проявляются все летальные и понижающие жизнеспособность мутации, которые могут быть замаскированы у диплоидов за счет работы второго генома. Сравнив выживаемость таких андрогенетических гаплоидов и тех, что развиваются при осеменении инактивированной икры нативной спермой, можно понять, насколько поврежден генетический аппарат спермиев под действием заморозки.
Половой состав потомства
Коль скоро речь идет об андрогенезе для воссоздания геномов редких и исчезающих видов осетровых рыб, естествен вопрос о половом составе потомства. Если оно состоит из самок и самцов, это обеспечит воспроизводство вида в ряду поколений обычным половым путем.
Каким же может быть половой состав потомков, получаемых с помощью диспермного андрогенеза? Ответ совсем непрост. Если пол у осетровых рыб определяется половыми хромосомами, состав андрогенетического потомства будет зависеть от того, гетеро- или гомогаметны самцы. При мужской гетерогаметности (генотип самцов XY, самок - XХ) за счет диспермного андрогенеза (слияния ядер двух спермиев) должны появиться самки XX и самцы XY и YY в соотношении 1:2:1. При мужской гомогаметности (генотип самцов ZZ, самок - ZW) андрогенетическое потомство будет состоять только из самцов ZZ, а для получения самок потребуется дополнительная процедура по гормональному переопределению пола.
* Гетерогаметный пол производит два или более типов гамет (половых клеток - спермиев, яйцеклеток) с разными половыми хромосомами, например X и Y или W и Z. - Примеч. ред.
Отметим: у осетровых рыб количество хромосом, причем мелких, довольно велико - у диплоидных видов 120, у тетраплоидных примерно 250 (для сравнения: у человека - 46). Поэтому прямая идентификация половых хромосом невозможна [12]. В этой ситуации изучать механизм определения пола можно косвенным путем - исследуя половой состав гиногенетического потомства, т.е. с исключительно материнской наследственностью. К настоящему времени известны всего две такие работы, выполненные на веслоносе (Polyodon spatula) и американском белом осетре (A.transmontanus) [13, 14]. В первой работе был сделан вывод о мужской гетерогаметности исследуемого вида, во второй - высказано предположение о женской гетерогаметности. Учитывая эти результаты, нельзя исключить, что пол у разных видов осетровых рыб может определяться разными системами, как, скажем, у тиляпий [15]. У рыб вообще пол может меняться даже в зависимости от условий окружающей среды, например от температуры. Поэтому делать окончательные выводы о механизме определения пола у осетровых рыб, основываясь на результатах изучения только гиногенетических потомств двух видов, по крайней мере преждевременно. Надежнее было бы использовать для этого также потомков с чисто отцовской наследственностью.
Соотношение полов в андрогенетическом потомстве в зависимости от механизма определения пола.
Мы изучаем механизм определения пола осетровых, исследуя (впервые) оба потомства - и андрогенетическое, и гиногенетическое. С помощью мейотического гиногенеза, для индукции которого инактивируем ядра сперматозоидов УФ-облучением и тепловым шоком подавляем второе деление мейоза в икре, уже получили жизнеспособных диплоидных гиногенетических потомков русского осетра и севрюги [6]. Мы полагаем, что, независимо от того, какой пол у осетровых гетерогаметный, заключение о механизме определения будет достаточно надежным, если сравнить гиногенетических и андрогенетических потомков одних и тех же видов.
* * *
Итак, мы разработали два метода диплоидного андрогенеза у рыб, первыми получили жизнеспособные андрогенетические потомства нескольких видов осетровых, а также ядерно-цитоплазматических гибридов. Достигли успеха в преодолении несовместимости ядра с цитоплазмой у таких гибридов и в использовании криоконсервированной спермы для диспермного андрогенеза. Многие направления исследования, в частности изучение механизма определения пола осетровых рыб, фактически только начаты. Но уже сегодня ясно, что метод диспермного андрогенеза может использоваться для восстановления и сохранения генофондов редких и исчезающих видов осетровых рыб.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект 06-04-49637) и подпрограммой “Биоразнообразие” Президиума РАН (проект № 6.1.9).
Список литературы
1. Veprintsev B.N., Rott N.N. // Nature. 1979. V.280. P.633-634.
2. Grunina A.S., Neyfakh A.A. // Physiol. Gen. Biol. Rev. 1997. V.12. P.73-103.
3. Corley-Smith G.E., Brandhorst B.P. // Mol. Reprod. Devel. 1999. V.53. P.363-367.
4. Birstein V.J., Hanner R., Salle R.de // Sturgeon Biodiversity and Conservation / Eds V.J.Birstein et al. Dordrecht, 1997. P.427-444.