Статья: Повышение эффективности использования гидроидов при биотестировании: выбор вида, сезона, температурного режима
* Отличия ог контроля с вероятностью 95%. ** То же, Р=99,0%.
Примечание. Опыты при температуре 18 и 22° были поставлены в мае. а при 14,5° в августе.
Данные по дедифференцировке гидрантов в эксперименте могут иметь значение для оценки токсического эффекта лишь при сопоставлении с контрольными значениями, которые сильно различались в перечисленных трех сериях опытов.Менее всего дедифференцировка гидрантов в контроле была выражена в материале, взятом весной из моря, накануне перед опытом, сильнее в лабораторной культуре и еще больше доля дедифференцировавшихся гидрантов в контроле была в августовском материале.Чем интенсивнее идет дедифференцировка гидрантов в контроле, тем сложнее использовать материал для биотестирования. Так, например, по абсолютным значениям дедифференцировавшихся гидрантов в опытах с действием ионов цинка было больше всего в августе, но и дедифференцировка в контроле была в это время самой большой. Поэтому нельзя утверждать, что в августе гидроиды более чувствительны к токсическому воздействию ионов цинка. Скорее мы приходим к обратному заключению, что именно весной, вскоре после перехода колоний в период активного роста благодаря относительно слабой дедифференцировке в контроле возможна более чуткая индикация пороговых значений токсических примесей.
5. Роль температурного режима в повышении чувствительности метода. Повышение температуры до некоторых пределов приводит к ускорению ряда физиологических процессов, в том числе у гидроидов: к ускорению роста колонии (Kinne, Paffenhofer, 1966; Tusov, Davis, 1971; Бурыкин, 1980), интенсивности дедифференцировки (Crowell, 1953) и формирования (Crowell, 1957) гидрантов, уменьшению периода ростовых пульсаций (Wyttenbach, 1974) и т. д. Поэтому мы попытались повысить чувствительность метода с помощью регистрации токсического эффекта при наиболее высокой температуре, близкой к верхней температурной границе существования этих гидроидов (табл. 2).
В мае колонии О. loveni, находящиеся в состоянии перехода из зимнего гипобиоза к активному росту, мы переносили в лабораторию и содержали при температуре 22,0°. Порог чувствительности к цинку оказался в этом случае не выше 0,25 мг/л. При 18° (параллельный эксперимент) и при 14,5° (август) пороги чувствительности гидроидов к ионам цинка оказались около 0,5 и 1,0 мг/л соответственно (табл. 2). Поэтому увеличение температуры можно рассматривать как один из путей повышения чувствительности метода.
Обсуждение результатов
Впервые достаточно высокая чувствительность гидроидов к цинку была обнаружена Карбе (Karbe, 1972). Он провел экспериментальные исследования гидроида Eirene viridula Eschscholtz, 1829, относящегося к сем. Campanulinidae, подотряд Thecaphora, и установил, что полипы чувствительны к ионам цинка при концентрации 1,5—3,0 мг/л.Вслед за Карбе английский исследователь Стеббинг (Stebbing, 1976, 1979, 1980b; Stebbing, Santiago—Fandino, 1983) подробно занялся возможностью использования гидроидов в качестве тестобъектов. Используя гидроид Obelia flexuosa (Hincks, 1861) из сем. Campanulariidae, подотряд Thecaphora, он показал, что колонии этого гидроида погибают при содержании в морской воде меди в концентрации около 0,05 мг/л, а кадмия—0,5 мг/л. Пытаясь обнаружить токсическое действие тяжелых металлов на организм гидроидов задолго до их гибели, Стеббинг стал использовать различные морфологические и физиологические показатели, например частоту образования гонозооидов (специализированных половых зооидов), скорость роста тела колонии, число зооидов в экспериментальных колониях по отношению к контролю. Таким способом Стеббингу удалось достоверно зарегистрировать эффект стимуляции роста колонии и частоты образования гонозооидов при очень малых концентрациях токсикантов (0,1 мкг/л меди и 0,05 мг/л кадмия) (Stebbing, 1980a, 1981). Этот эффект, известный ранее под названием закона АрндтаШульца, а затем “хормезиса”, был описан неоднократно для разных объектов (Stebbing, 1982). Для нас важно, что Стеббинг подробно изучил его проявление и по возможности механизм у гидроидов с целью практического использования этого эффекта для биотестирования (Stebbing et al., 1983).
Разрешающая способность метода очень велика. Тем не менее у него есть по крайней мере два недостатка. Прежде всего, “хормезис” проявляется в довольно узких рамках концентраций токсиканта. Если концентрация меди в воде уже 1,0 мкг/л и выше, то обнаружить это по увеличению частоты образования гонозооидов или по предлагаемому Стеббингом показателю скорости роста колонии уже нельзя вплоть до таких концентраций токсиканта. которые близки к летальным.Второй недостаток заключается в необходимости выращивания колонии более недели (по Стеббингу—11 сут) в исследуемой воде, прежде чем можно получить результаты для последующего анализа (Stebbing, Santiago—Fandino, 1983). Следовательно, для экспрессиндикации предложенная Стеббингом методика малопригодна.Используемый нами метод не обладает такой высокой разрешающей способностью. Так, для сравнения, по дедифференцировке гидрантов у Obelia loveni можно зарегистрировать через сутки токсическое воздействие меди при ее концентрации 10 мкг/л и выше (Карлсен, Марфенин, 1987). Однако и такая чувствительность гидроидов оказывается все же существенно выше, чем у других тестобъектов (Патин, 1982), а самое главное—используемый нами метод весьма прост, легко осуществим как в лабораторных, так и в полевых условиях, не требует больших затрат, времяемких измерений и позволяет получить результаты уже через 1—2 сут.
Метод основан на регистрации дедифференцировки гидрантов в эксперименте и контроле. Рассасывание гидрантов и частей колонии—характерное явление у гидроидов. Оно было обнаружено в начале нашего века (Thatcher, 1903; Huxley, DeBeer, 1923) и первоначально считалось результатом реакции колонии на неблагоприятные условия существования, в частности воздействия ядов.Хаксли и Де Вир на гистологических препаратах подробно исследовали весь процесс рассасывания гидрантов у О. geniculata и сравнили его с дифференцировкой в обратной последовательности—укорачиваются щупальца, смыкается гипостом, утоньшается и делается короче тело гидранта, становясь похожим на зачаток в момент начала дифференцировки гидранта. Исходя из этих особенностей процесса, они назвали его “дедифференцировкой”. Они же установили, что материал дедифференцировавшихся гидрантов поступает внутрь колонии и используется ею.
После того как колонии гидроидов научились содержать в лабораторных условиях (Fulton, 1960), выращивая их на стеклах, Кровеллом (Crowell, 1953) было обнаружено, что у кампануляриид дедифференцировка гидрантов—регулярный процесс, связанный с их (гидрантов) коротким жизненным циклом. На месте дедифференцировавшихся гидрантов через короткое время при благоприятных условиях образуются новые гидранты, которые, так же как и предшествовавшие им, примерно через неделю “старятся” и рассасываются.
Все это помогает лучше представить возможности повышения эффективности использования нашего метода для биотестирования. Пытаясь увеличить “разрешающую способность” предлагаемого метода, мы должны действовать одновременно в двух направлениях—искать способы повышения чувствительности гидрантов к токсикантам и в то же время пытаться уменьшить скорость рассасывания их в контроле.Что касается чувствительности объекта к токсикантам, то преждевсего следует выявить наиболее восприимчивые к ним виды гидроидов.. Ранее (Карлсен, Марфенин, 1987) мы уже установили, что из трех видов рода Obelia наиболее удачный для биотсстирования — О. lovеni.Испытание еще четырех видов гидроидов из разных семейств, результаты которого приведены в данной статье, показало, что они менее чувствительны к токсическому действию ионов цинка по сравнению с О. loveni. Следовательно, подтвержден сам факт различной восприимчивости гидроидов к токсикаптам, и дальнейший поиск наиболее чувствительных видов имеет смысл и должен быть продолжен.Можно ожидать, что степень влияния токсикантов на колонии различается на разных этапах их жизненного цикла. Действительно, в жизни колонии есть периоды, в течение которых токсический эффект, вероятно, трудно было бы установить. Это, например, гипобиотическое состояние во время зимней диапаузы или же период депрессии после размножения (Марфенин, 1980). С другой стороны, были основания предполагать, что переход из гипобиотического состояния к активному росту колонии или же период подготовки колонии к зимней диапаузе более восприимчивы к токсическим воздействиям.
Мы не проводили систематического изучения этого вопроса, а ограничились сравнением действия цинка на двух этапах жизненного цикла колонии, первый из которых соответствует переходу из гипобиотического к активному состоянию ранней весной, а второй—росту после размножения в конце лета. Можно считать, что различие в степени проявления токсического эффекта подтвердилось, однако это произошло на фоне еще более значительных различий в контроле. Это служит хорошим примером того, что уменьшение дедифференцировки гидрантов в контроле—не менее важный путь увеличения разрешающей способности методики. Эффективность метода можно также повысить, работая при более высоких температурах.
Если же подойти к проблеме повышения эффективности использования гидроидов для биотестировапия со стороны совершенствования контроля, то и в этом случае, судя по полученным нами результатам, можно надеяться на весомый успех. Почти в 20 раз различалась доля дедифференцировавшихся гидрантов в контроле через 20 ч после начала эксперимента у колоний при переходе из гипобиотического состояния, с одной стороны, и летнем материале—с другой. При переходе колоний к активному росту после зимней диапаузы все гидранты начинают расти одновременно и, следовательно, должны дедифференцироваться также одновременно—приблизительно через 1 нед. Этим объясняется столь низкое значение доли дедифференцировавшихся гидрантов в контроле у апрельской серии через 20 ч. Достаточно было провести эксперимент на материале, уже адаптированном к комнатной температуре, т. е. через 1—2 нед после начала роста колоний, как доля дедифференцировавшихся гидрантов в тех же условиях стала существенно выше.
Через 2 сут после начала эксперимента дедифференцировка гидрантов в контроле всегда возрастала. Это связано с тем, что по условиям предлагаемой методики побеги с гидрантами не получали пищи. Голодание ускоряло рассасывание и одновременно делало более редкой дифференцировку новых гидрантов.
Таким образом, в результате проведенных исследований стало ясно, что для биотестирования лучше всего использовать колонии в период .перехода их из состояния покоя в состояние активного роста. По дедифференцировке гидрантов в течение 1 сут можно достоверно зарегистрировать токсический эффект малых концентраций ионов цинка в воде, .которые, как показали долгосрочные эксперименты, являются сублетальными даже для испытываемых видов гидроидов, а тем более для других организмов.
Список литературы
Бурыкин Ю. Б. Регулирующая роль некоторых экологических факторов в процессах роста и интеграции колониальных гидроидов//Теоретическое и практическое значение кишечнополостных. Л.: ЗИН АН СССР, 1980. С. 16.
Бурыкин Ю. Б., Марфенин Н. Н„ Карлсен. А. Г. Опыт содержания мирского колониального гидроида Dynamena pumiia (L.) и лабораторных условиях//Научн. докл, высш. школы. Биол. науки. 1984. № 1. С. 102.
Карлсен. А. Г., Аристархов В, М. Изменение постоянным магнитным полем токсического действия растворов хлорида цинка на колониальных гидроидов Obelia loveni и Obelia flехиоsа//Изв. АН СССР. Сер. биол. 1986. № 2. С. 230—237.
К.арлсен А. Г., Марфенин 11. Н. Действие повышенных концентраций ионов цинка на некоторых гидроидов//Научн. докл. высш. школы. Биологические науки, 1987,№ 1, с. 71—73
Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1980. С. 104, 271. Марфенин Н. Н. Основные морфофункциональные состояния колонии у гидроида Dynamena pumiia (L.) в естественных условиях//Докл. АН СССР. 1980. Т. 255. № 1.С. 253.
Патин, С. А. Особенности распространения и биологического действия загрязняющих веществ в Мировом оксане//Человек и биосфера. М.: Издво МГУ, 1982. Вып. 7.С. 62.
Baier R. W. Wojnowich G., Petrie L. Mercury loss from culture media//Analyt. Chem. 1975. V. 45. P. 2464.
Crowell S. The regressionreplacement cycle of hydranths of Obelia and Campanularia//Physiol. Zool. 1953. V. 26. № 4. Р. 319.
Baier R. W., Wojnowich G., Petrie L. Mercury loss from culture media//Analyt. Chem. 1975. V. 45. P. 2464.
Crowell S. The regressionreplacement cycle of hydranths of Obelia and Campanularia//Physiol. Zool. 1953. V. 26. № 4. Р. 319.
Crowell S. Differential responses of growth zones to nutritive level, age, and temperature in the colonial hydroid Campanularia//J. Expti Zool. 1957. V. 134. P. 63.
Fulton С. Culture of a colonial hydroid under controlled conditions//Scicnce. 1960,V. 132. P. 473.
Huxley !. S. DeBeer G. R. Studies in dedifferentiation. IV. Resorption and differential inhibition in Obelia and Campanularia//J. Microscop. Sci. 1923. V. 67. P. 473.
K.arhe L. Marine Hydroiden als Testorganismen zur Prufung der Toxizitat von Abwasserstoffen. Die wirkung von Schwermetallen auf Kolonien von Eirene viridula//Marine Biol. 1972. В, 12. № 4. S. 316.
Kinne 0., Paffenhoger G. A. Growth and reproduction as a function of temperature and salinity in Clava multicornis (Cnidaria, Hydro2oa)//Helgolander wiss. Meeres. 1966.В. 13. № 1—2. S. 62. Stebbing A, R. D. The effect of low metal levels on a clonal hydroid//J. mar. biol. Ass.U. K. 1976. V. 56. P. 977.