Учебное пособие: Молекулярные основы канцерогенеза. Онкогены
Опухоль, развивающаяся в организме человека, оказывает постоянное и по мере прогрессирования все более усиливающееся воздействие на обмен веществ, вызывая в итоге нарушения гомеостаза, не совместимые с жизнью.
На относительно ранних этапах опухолевого роста происходит, как считают некоторые авторы, анемизация организма, т.е. недостаточное снабжение тканей кислородом. Этим объясняется повышенный расход глюкозы, а как следствие этого – стимуляция фосфоролиза гликогена в печени, увеличение глюконеогенеза, мобилизация триацилглицеринов (TAG) и образование кетоновых тел. Повышение концентрации липидов в крови ухудшает вязкостные свойства крови и еще больше увеличивает дефицит кислорода. В организме больного развивается также дефицит витаминов, в частности С и Е, являющихся антиоксидантами и снижающими явления перекисного окисления липидов (ПОЛ). Рост опухоли сопровождается увеличением содержания продуктов ПОЛ и повреждением структуры мембран.
Развитие рака и возникающие при этом гипоксия и самоподкисление опухоли изменяют функционирование эндокринной системы: способствуют возникновению резистентности к инсулину и реактивной гиперинсулинемии, гиперпродукции АКТТ, пролактина, тиреотропина и глюкокортикоидов. Последние, стимулируя глюконеогенез из тканевых белков, неблагоприятно воздействуют на клетки иммунной системы, вызывая их деструкцию по механизму апоптоза, что приводит к стойкой иммуносупрессии. В период максимального роста опухоли в тимоцитах и Т-лимфоцитах селезенки ингибируется синтез ДНК на уровне синтеза предшественников – дезок-сирибонуклеозидтрифосфатов.
В центре неоплазмы часто возникают участки некроза, продукты которого всасываются в кровь и разносятся по организму, вызывая повышение температуры тела и другие проявления общей интоксикации.
ФАКТОРЫ, СТИМУЛИРУЮЩИЕ КАНЦЕРОГЕНЕЗ
Около 80% случаев рака у людей являются результатом воздействия факторов окружающей среды, под которыми понимают стиль жизни (курение, производственные контакты с канцерогенами), пищевые продукты (зерновые, зараженные плесенью Aspergillusflavus, пищевые добавки, содержащие нитриты и вторичные амины), заболевания, увеличивающие риск развития опухолей: так, цирроз печени в ряде случаев ведет к развитию гепатоцеллюлярной карциномы, а язвенный колит – аденокарциномы толстой кишки и т.д. Склонность к опухолеобразованию может стимулироваться возрастом и наследственными изменениями генома. Например, предрасположенность к ретинобластоме или множественному полипозу толстой кишки наследуется как аутосомио-доминантный признак, а нестабильность хромосомной ДНК – как аутосомно-рецессивный.
Физические, химические и биологические воздействия, вызывающие трансформацию клеток, называют канцерогенными воздействиями. К ним относят:
• рентгеновские, γ иУФ-лучи, которые оказывают как прямой повреждающий эффект на структуру ДНК за счет появления разрывов в нитях и нарушений в структуре азотистых оснований» так и непрямой, вызванный действием на макромолекулы свободнорадикальных форм кислорода, образующихся в тканях под воздействием облучения;
• химические вещества: полициклические ароматические углеводороды [бензо(а) пирен, диметилбензантрацен и др.}, ароматические амины и аминоазосоединения (2‑нафтиламин, 2‑ацетиламинофлуорен), нитрозамины и амиды, афлотоксины, некоторые лекарственные препараты, являющиеся алкилирующими или ацилирующими агентами: циклофосфамид, бисульфан, диэтилстильбэстрол и др. Большинство из указанных соединений сами по себе не являются канцерогенами, но превращаются в них, подвергаясь в печени воздействию ферментов универсальной системы детоксикации ксенобиотиков (рис. 3.3). Образуются эпоксиды, свободные радикалы, ионы карбония или катионы, активные электрофильные группы которых взаимодействуют с нуклеофильными центрами в молекулах ДНК, РНК или белков, нарушают функционирование генетического материала и вызывают возникновение неоплазм;
• ДНК- и РНК-содержащие вирусы, которые встраиваются в клеточный геном и экспрессируют гены и белковые продукты, вызывающие неопластическую трансформацию. Такие гены стали называть онкогенами.
Данные о роли вирусов в развитии опухолей были получены в начале XX столетия. Так, в 1908 г. V. Ellerman и O. Bang вызвали лейкоз у кур воздействием бесклеточного экстракта из опухолевых клеток, а в 1910 г. Rous описал первый онкогенный вирус, способный инициировать саркому у кур. В 1968 г. Л.А. Зильбер сформулировал вирусно-генетическую теорию возникновения неоплазм под действием онкогенных вирусов. Вирусный канцерогенез первоначально был описан только у птиц и животных. В последнее время получены данные об участии вирусов в развитии некоторых опухолей у человека: ДНК-содержащего вируса Эпштейна – Барр в развитии лимфомы Беркитта и назофарингеальной карциномы, ДНК папилломавируса – рака кожи и гениталий; РНК-содержащих вирусов: иммунодефицита человека HIV в возникновении сарком, Т-клеточного лимфотропного вируса HLTV 1 как причины некоторых видов Т-клеточных лимфом и лейкемий и др.
ДНК-содержащие вирусы частично или полностью встраиваются в клеточный геном человека, экспрессируют вирусные гены и образующиеся белки в ядре, нарушают реализацию клеточной программы. Так, Т-антиген вирусов SV40 и полиомы, Е7 вируса папилломы человека связываются и инактивируют белки-репрессоры опухолей Rb и / или р53.
К ДНК-онковирусам относят также вирус герпеса, аденовирус, паповавирус, вирус ветряной оспы. Как правило, эти вирусы вызывают инфекционные болезни и лишь в одном из миллиона случаев – злокачественную трансформацию. ДНК-содержащий вирус гепатита В является причиной рака печени, от которого в мире умирает ежегодно около 500 000 человек, хотя и в этом случае инфицирование, как правило, происходит за 20–25 лет до возникновения опухоли.
РНК-онковирусы являются ретровирусами. Попадая в клетки человека, они синтезируют ДНК с помощью обратной транскриптазы и включают ее в эукариотический геном в виде провируса. В 1976 г. при помощи техники рекомбинантных ДНК в ретровирусе саркомы Рауса была расшифрована структура генетического материала (рис. 3.4) и наряду с тремя обычно встречающимися у всех вирусов генами обнаружен ген, ответственный за злокачественную трансформацию и названный src‑онкогеном. Показано, что если src‑ген встраивается в геном нормальных клеток, растущих в культуре, то они теряют способность к контактному торможению и приобретают все свойства трансформированных клеток.
В 1989 г. Д. Бишоп и Г. Вармус на РНК-содержащих вирусах установили, что онкогены не присущи вирусам исходно, но заимствованы из генома тех клеток, в которых они обитают. За время существования в составе вирусного генома они подвергаются многочисленным мутациям и приобретают онкогенные свойства. В некоторых случаях вирусы не содержат онкогенов, но достаточно случайного внедрения в геном человека чужеродного генетического материала, содержащего энхансеры, или усилители транскрипции, чтобы поменялась экспрессия соседних с ним генов хозяина и произошла их трансформация.
Исследования структуры генома млекопитающих и человека показали, что в эукариотических клетках гены, кодирующие ФР, рФР, транскрипционные факторы и другие белки, вовлеченные в регуляцию роста и дифференцировки, являются структурными аналогами онкогенов, т.е. теми исходными генами, из которых онкогены возникли. Эти нормальные клеточные гены, прототипы онкогенов, не обладают трансформирующими свойствами и их называют протоонкогенами.
В настоящее время изучены десятки вирусных онкогенов, из которых более 50% кодируют в клетках тирозиновые про-теинкиназы (тир-ПК), а остальные содержат информацию о различных функционально активных белках: укороченном факторе роста тромбоцитов (ФРТ), укороченном рецепторе эпидермального фактора роста (рЭФР), ДНК-связывающих, ГТФ-связывающих и некоторых других регуляторных белках.
МЕХАНИЗМЫ НЕОПЛАСТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ
Вирусные онкогены ответственны за очень небольшую часть неоплазм человека, поэтому внимание молекулярных онкологов главным образом сосредоточено на клеточных онкогенах. Последние возникают в результате точечных мутаций в кодирующих и регуляторных областях протоонкогенов, их амплификации (увеличение числа копий) и активации под влиянием экзогенных промоторов, утраты отдельных аллелей и генных локусов при делениях и хромосомных перестройках, модуляции экспрессии генов на уровне транскрипции и трансляции (рис. 3.5). Показано, что рак чаще возникает из соматических клеток, чем из половых, поэтому можно сказать, что соматические мутации являются причиной основного числа опухолей.
Установлено, что в регуляции роста и дифференцировки зслеток принимает участие более 100 различных генов и около 10 генов – супрессоров опухолевого роста, или антионкогенов (табл. 3.1). Продукты многих онкогенов имеют структурную гомологию с такими ФР и рФР, как эпидермальный ФР (ЭФР), ФР тромбоцитов, ФР фибробластов, инсулиноподобными факторами 1 или 2.
Они обладают либо протеинкиназной активностью, либо являются аналогами регуляторшлх белков мультиферментньпс циклиновых комплексов или ДНК-связывающих белков. Антионкогены (р53, pRb, р21, р16, WT1) кодируют регуляторные белки, сдерживающие репликативный потенциал клеток, поэтому их инактивация влечет за собой нарушение контроля клеточной пролиферации.
В последнее время внимание исследователей-онкологов привлекли гены, кодирующие циклины и циклиизависимые киназы: нормальные регуляторы клеточного цикла и их ингибиторы. Существует также большая группа генов-модуляторов, не вызывающих трансформации, но способствующих распространению опухоли в организма (гены главного комплекса гистосовместимости иммунного ответа; гены, контролирующие функционирование протеолитаческих ферментов, и др.).
Малигнизация клеток является следствием каскадного накопления в геноме различных нарушений. Для развития рака необходимо, чтобы произошли изменения не менее чем в 6 – 10 генетических факторах (теория многоступенчатого канцерогенеза). Изменения в пределах всего одной копии или аллеля протоонкогена достаточны для превращения его в онкоген с возросшей стимулирующей пролиферацию активностью, т.е. онкогены можно рассматривать как доминантные трансформирующие гены. Антионкогены, напротив, проявляются рецессивным образом т.е. для нарушения клеточной пролиферации и дифференцировки необходима инактивация обоих аллелей. Присутствие изменений в обоих аллелях переводит клетку из гетерозиготного в гомозиготное состояние, т.е. наблюдается потеря гетерозиготности – lossofheterozygosity (LOH). Среди генов – супрессоров опухолей исключением является ген р53, повреждение в одном из аллелей которого ведет к изменению функций белка.
Спектр изменений генетического материала в каждой конкретной опухоли имеет индивидуальный характер, однако наличие общих закономерностей для неоплазм определенной локализации дает основание связывать их с патологией определенного органа (см. табл. 3.1).
В большинстве опухолей обнаруживается сразу несколько онкогенов. Особенно часто встречаются мутации в генах – супрессорах опухолей, которые кодируют белки, ингибирующие аномальный рост и трансформацию клеток.
Описано более 10 супрессорных белков. Наиболее изученными из них являются Rb и р53. Так, при ретинобластоме – редком детском онкологическом заболевании сетчатки глаза наблюдается инактивация гена Rbl, кодирующего ядерный белок с мол. массой 105 000. В норме этот белок ингибирует пролиферацию клеток, так как способен связываться и инактивировать транскрипционный фактор EF2, который в свою очередь усиливает экспрессию ростстимулирующих белков и ферментов: ДНК-полимеразы α (рис. 3.6). Однако Rb перестает влиять на переход клетки из G, в S‑период, если он фосфорилирован или инактивирован связыванием с другими белками-ингибиторами, а также в результате мутаций в гене. Это стимулирует пролиферативный процесс.
Другим антионкогеном является Р53. Его функция наиболее часто нарушена у онкологических больных. Этот антионкоген кодирует ядерный белок с мол. массой 53 000, которой, будучи транскрипционным фактором, контролирует в клетках чрезвычайно важные функции: после повреждения ДНК ингибирует пролиферацию и активирует ее репарацию, но если последняя невозможна, то побуждает клетки к апоптозу, а также подавляет ангиогенез в опухолях.
Белок Р53 состоит из трех доменов: регулирующего транскрипцию, обеспечивающего связывание с ДНК и ответственного за олигомеризацию. Он связывается с регуляторными участками ДНК в виде тетрамера и имеет значительное число генов-мишеней, в которых есть последовательности, способные присоединять Р53 и таким образом менять свою активность (рис. 3.7). К генам, экспрессия которых зависит от Р53, относится ген wafl, кодирующий белок – ингибитор циклинзависимой киназы. В последние годы в клетках обнаружена группа белков – циклинов, которые активируют более десятка гомологичных по структуре сер/тре-ПК, названных циклинзависимыми протеинкиназами. Образуя комплексы с циклинами, эти ПК фосфорилируют белки, осуществляющие продвижение клетки по клеточному циклу и обеспечивающие преодоление G1/S и G2/M проверочных точек. Белок Р53 увеличивает экспрессию гена waf l и синтез белка р21.
Другим геном, транскрипция которого усиливается Р53, является gadd 45. Показано, что экспрессия этого гена возрастает в клетках, подвергнутых ионизирующей радиации.
Два гена – bcl‑2 и Ьах, чувствительные к Р53, регулируют разрушение клеток путем апоптоза. Однако присоединение к регуляторному участку Р53 прекращает экспрессию гена bcl‑2, являющегося ингибитором апоптоза, и активирует ген bах, который стимулирует апоптоз.