Учебное пособие: Предмет і завдання вивчення гістології з цитологією та ембріологією

Другим етапом цього процесу є фіксація матеріалу. Її здійснюють відразу ж після вирізування шматочка. Полягає вона в зануренні його в фіксуючу рідину. Метою фіксації є збереження гістологічних структур. Фіксатором може бути 5— 10 % розчин формаліну: він швидко проникає у тканини, добре їх фіксує, легко видаляється після промивання у воді.

Фіксаторами є оцтова, пікринова, осмієва кислоти, нейтральний 10% форма­лін, етиловий та метиловий спирт. При необхідності застосовують різні складні фіксуючі суміші, які містять названі компоненти у різних співвідношеннях.

Третій етап виготовлення гістологічного препарату — зневоднення фіксова­ного матеріалу. Для цього використовують спирти зростаючої концентрації (від 50 до 100 градусів). Після зневоднення матеріал ущільнюється. Його здійснюють у насиченому розчині рідкого парафіну в ксилолі при температурі 37° С, а потім в рідкому парафіні при температурі 55° С. У парафіні об'єкт просочується, йому дають змогу затвердіти при кімнатній температурі разом з парафіном у спеціаль­ній формочці. Блок для електронної мікроскопії одержують ущільненням об'єк­ту в органічних смолах. Зрізи виготовляють на спеціальних приладах-мікротомах (для світлової мікроскопії тонкі зрізи товщиною 8 мкм, напівтонкі 0,5—1 мкм); для електронної мікроскопії ультратонкі зрізи — 0,05—0,2 мкм виготовляють на ультрамікротомах.

Забарвлюють зрізи для збільшення контрастності зображення окремих стру­ктур при розгляді їх у мікроскопі. Методи забарвлення гістологічних структур різноманітні. Вибір їх залежить від мети дослідження. Гістологічні барвники за походженням поділяють на кислі, основні та нейтральні. Кислий фарбник — еозин — забарвлює цитоплазму в рожево-жовтий колір; це синтетичний фарб­ник. Структури, що фарбуються кислими фарбниками, називають оксифільними. Основні фарбники забарвляюють ядра клітин і тому їх називають ядерними. Прикладом є гематоксилін — фарбник рослинного походження. Він фарбує яд­ро клітини в синьо-фіолетовий колір. Гістологічні структури, що здатні забарв­люватися основними барвниками, називають базофільними. Структури, що

сприймають кислі та основні барвники, є нейтральними. Вони утворюються при сполученні водних розчинів кислого і основного барвників.

У гістологічній техніці знаходять широке використання спеціальні барвни­ки. За їх допомогою фарбують речовини певної хімічної природи. Наприклад, альціановий синій використовують для визначення кислих глікозаміногліканів. Судан IIIзабарвлює нейтральні жирові речовини в оранжевий колір, судан чо­рний В — ліпіди в чорний колір. Для забарвлення нервової тканини успішно користуються методикою імпрегнації азотнокислим сріблом тощо.

Після фарбування зрізи відмивають від залишку фарбника, зневоднюють етиловим спиртом, просвітлюють ксилолом, потім вміщують в тонкий шар ба­льзаму між предметним та покривним скельцями. Бальзам і скельця мають май­же однаковий показник заломлення світла, що запобігає розсіюванню променів при проходженні їх через товщу препарату. Основний недолік цього класичного способу виготовлення препарату — поява штучного утворення — артефакту, що може бути причиною одержання негативних результатів. Однак, знаючи законо­мірності фіксування та зневоднення, артефактів можна уникнути. Так, якщо матеріал довго зберігати у формаліні, у ньому можуть утворитися темні пігмент­ні зерна. Щоб запобігти їх появі, препарат ретельно промивають у проточній воді. Інша справа, коли порушують правила виготовлення препарату, з'явля­ються волокна тканини, якою протирають скельця, пухирці повітря при накри­ванні препарату покривним скельцем, осад фарб, зазубрини мікротомного но­жа, складки зрізу.

Крім основного класичного методу, в гістології існує багато інших, які за­стосовують залежно від мети дослідження. Зокрема це такі методи:

флуоресцентна мікроскопія, яка дає змогу вивчити як власну (первинну) флу­оресценцію речовин, так і вторинну, викликану фарбуванням клітинних струк­тур спеціальними барвниками-флуорохромами. Останні, при взаємодії з різни­ми компонентами клітини, утворюють специфічне світіння відповідних струк­тур. Так, флуорохром — акридиновий оранжевий з ДНК дає зелене світіння, а з РНК — червоне.

Метод темнопольової мікроскопії полягає в тому, що дрібні часточки, які лежать за межами дозволеної здатності мікроскопа, стають видимими в проме­нях, що йдуть під таким великим кутом і в об'єктив вони безпосередньо не потрапляють. В об'єктив потрапляє лише світло, відбите від цих часточок, і вони мають вигляд світлих цяточок по темному фоні. Цей метод є цінним при вивченні живих колоїдів клітини. Є інші, широко використовувані методи: гіс­тохімічний, ауторадіографічний, імуногістохімічний.

Мікрургія клітини і фракціонування клітинних стуктур. При вивченні власти­востей живої клітини значне місце належить так званій мікрургії, яка дає змогу за допомогою спеціальних мікроманіпуляторів здійснювати операції на клітині. Із застосуванням мікрургії вивчають реакції на пошкодження і вилучення її різ­них складових частин — ядра, ядерця, окремих хромосом.

Різновиди мікрургії вивчають локальний вплив на окремі частини хромосом вузького пучка променів (-гамма-променів, протонів, ультрафіолетових).

В цитології вивчають хімічний склад і властивості ізольованих структур та органоїдів клітин. Ізоляції їх досягають шляхом подрібнення тканин у гомогені­заторах, при цьому руйнуються клітинні оболонки. На фракції гомогенат поділяється в результаті центрифугування. Опрацьовані засоби центрифугування го­могенатів у ступінчастому градієнті щільності. При цьому у пробірці нашарову­ються розчини сахарози, що спадають від дна щільності, останнім нашаровуєть­ся гомогенат.

Центрифугування вмісту такої пробірки дає змогу одержати різні фракції по її вертикалі від найважчих (ядра, ядерця), які опускаються на дно і найлегших, які розміщуються ближче до поверхні (рибосоми, хромосоми, лізосоми).

Цитоспектрофотометрія дає змогу визначити кількісний вміст речовин у клі­тині та їх складових елементів по поглинанню ними світлових променів певної довжини хвилі.

Авторадіографія. За цим методом аналізують розміщення у клітинах і ткани­нах речовин, які помічено радіоактивними ізотопами. Методом авторадіографії виявляють місця синтезу певних речовин, склад білків, шляхи внутрішньоклі­тинного транспорту. Ізотопи, введені в клітини, відновлюють бромисте срібло фотоемульсії, що покриває зріз. Після проявлення фотоемульсії помітні зерна срібла (треки), що свідчить про розміщення в клітинах мічених речовин.

Імуноцитохімічний метод дослідження. Для вивчення деяких складових біл­кового обміну користуються здатністю високомолекулярних речовин-антигенів викликати в клітинах утворення захисних глобулінів (антитіл) і з'єднуватися з ними в комплекси. Приєднання до одного глобуліну флуоресціюючої речовини дає змогу виявити локалізацію іншого.

Гістохімічні методи дослідження. З їх допомогою виявляють хімічну природу складових елементів клітин і міжклітинної речовини, тканин тваринного органі­зму. В основі гістохімічних методів застосовують специфічні хімічні реакції. За їх допомогою виявляють нуклеїнові кислоти, білки, амінокислоти, ліпіди, вугле­води, ферменти.

Електронна мікроскопія дає змогу виявляти субмікроскопічну будову клітин. При електронній мікроскопії використовують потік електронів, джерелом яких є розжарена вольфрамова нитка-катод. Під впливом підвищеної напруги в 80 кВт електрони набувають великої швидкості і спрямовуються до аноду, в центрі якого є отвір, через який вони проходять. В сучасних трансмісійних (просвічую­чих) електронних мікроскопах роздільна здатність становить 0,1—0,7 нм. Метод скануючої електронної мікроскопії забезпечує об'ємне вивчення поверхонь об'єк­тів дослідження.

Прижиттєве дослідження тканин. Живі тканини культивують за межами ор­ганізму. Шматочки тканини об'ємом до 1 мм² , одержані стерильно при міні­мальному пошкодженні, розміщують у спеціальну камеру на слюду чи покривне скельце, де міститься штучне живильне середовище з відповідною температу­рою. Клітини в складі тканинних культур, особливо ембріональних, зберігають життя, діляться, здатні до гістологічної диференціації.

Значно поширений спосіб одношарових культур, у якому використовують клітини, одержані при подрібненні тканини дією трипсину. Метод прижиттєво­го дослідження тканин дає змогу простежити рух клітин, їх поділ, ріст, реакти­вні зміни на дію різних факторів. З цією метою застосовують уповільнене фото­графування.

3. Основи цитології. Історія розвитку.

Цитологія (від гр. цитос — комірка, клітина) — наука про походження, будову та функціональне значення елементарних жи­вих систем організму. Термін «клітина» вперше застосував англій­ський фізик Р.Гук (1665), який за допомогою збільшуваних лінз розглядав зрізи пробки, серцевини бузини, а також стебла та коре­ні різних рослин. У рослинній речовині Р.Гук називав клітинами правильно розміщені пустоти. М.Мальпігі (1671), Н.Грю (1671) під­твердили спостереження Р.Гука і назвали ці утворення «мішечка­ми», «міхурцями». Н.Грю вважав, що ці «міхурці» об'єднуються в структури, які нагадують текстильні утворення і назвав їх «ткани­нами».

При всій невідповідності назв об'єктів, які називали термінами «клітина» та «тканина» вони збереглися й до цього часу. Пізніше А.Левенгук (1677—1680) — мистецький шліфувальник лінз, спосте­рігав одноклітинні організми і вперше побачив еритроцити та спермії тварин. Мікроскопісти XVIIстоліття, які спостерігали вперше клі­тини ссавців, не зіставляли їх з клітинами рослин. В середині XVII століття, тобто майже через століття після Мальпігі та Грю, досяг­нення оптичної техніки були такі незначні, що спостереження та рисунки мікроскопістів того часу мало відрізняються від описуван­ня і зображень, зроблених у XVII столітті.

Початок успішного вивчення клітин пов'язаний з розвитком мікроскопування. В кінці XVIII на початку XIX століття були ство­рені ахроматичні мікроскопи, завдяки яким стали достовірнішими мікроскопічні спостереження, що дало змогу здійснити системати­чне вивчення структурних елементів різноманітних тваринних та рослинних організмів. На той час змінилася уява про будову клітин, основним в організації клітини стали вважати не клітинну стінку, а її вміст — протоплазму. Поступово збагачувався матеріал про мікроскопічну організацію тварин і рос­лин та будову клітин (cellula), названих так ще Р. Гуком.

У той час незалежно один від другого рядом дослідників в клітинах рослин і тварин були відкриті ядра, що створило необхідну передумову для висунутого в 1837р. Пуркіньє положення про подібність в будові тваринних і рослинних клі­тин.

У 1838—1839 рр. Т.Шванн узагальнив усі попередні мікроскопічні дослі­дження і сформулював клітинну теорію. Він розглядав клітину як універсальний структурний компонент тваринних і рослинних організмів. У книзі «Мікроско­пічні дослідження про відповідності в структурі і рості тварин і рослин» показа­но, що клітинна теорія стала найважливішою подією в біології, одним із вирі­шальних доказів єдності походження усієї живої природи. Вона значно вплину­ла на розвиток біології, медицини, інших наук. Основний зміст та значення клітинної теорії наведені в попередньому пункті.

Великий внесок у вивчення клітини і розвиток клітинної теорії було зробле­но в середині XIXстоліття реформатором наукової і практичної медицини патологом Р.Вірховим (1858), який довів, що основою таких процесів як запа­лення, дистрофії, новоутворення та інші є ті чи інші зміни в клітинах, і обґрунтував нові напрями досліджень: целюлярну фізіологію та целюлярну патологію.

Розвиваючи дані своїх попередників про спадкоємність розмноження клі­тин шляхом їх поділу Р.Вірхов висунув відому тезу: «Кожна клітина від клітини» — «Omniscellulaecellula», яка не втратила свого значення і нині, але була в подальшому обґрунтована на молекулярному рівні.