Дипломная работа: Дослідження антагоністичних властивостей сучасних пробіотиків

Вступ

В сучасний період вивчення нормальної мікрофлори привертає до себе все більшу увагу як в загальнобіологічному плані, так і у клінічному напрямку в зв`язку із тим, що накопичується все більше даних, шо зміни у нормальній мікрофлорі є проявом порушення гомеостазу макроорганізму, яке патогенетично повязане із виникненням різних патологічних станів (кишкові, госпітальні інфекції та ін.).

Організм людини і тварин піддається взаємодії цілого комплексу несприятливих факторів, які впливають на нормальне функціонування основних систем життєдіяльності. З однієї сторони це широке використання пестицидів, різноманітних харчових добавок, консервантів, барвників, недостатнє, нераціональне харчування більшості населення країни, а з іншої – масове безконтрольне застосування хіміотерапевтичних препаратів, в тому числі антибіотиків. З цим і рядом інших факторів повязують збільшення частоти виникнення дисбактеріозів у людей різних вікових груп. Про це говорить ріст гастроентерологічних захворювань[1].

Нормальна мікрофлора складає конкуренцію для патогенів, і механізми пригнічення їх росту досить різноманітні: вибіркове зв'язування поверхневих рецепторів клітин, особливо епітеліальних; виражений антагонізм, направлений проти патогенних видів. Подібні властивості виражені у біфідобактерій і лактобактерій, цей антибактеріальний потенціал утворює секреція кислот, спиртів, бактеріоцинів, лізоцима і т.д. Окрім того, висока концентрація вказаних продуктів інгібує виділення токсичних субстанцій патогенними видами.

Вивчення мікрофлори кишечника почалось з 1886 року, коли один із початківців вчення про кишкові інфекцїї F.Esсherich вперше описав кишкову паличку (Bacterium coli communae). Неоцінимий вклад у вивчення кишкового мікробіоценозу і можливостей його корекції вніс І.І.Мечніков, який в 1907р. висунув положення, що причиною виникнення багатьох захворювань являється дія на тканини і клітини макроорганізму різноманітних токсинів і метаболітів, які продукуються мікробами, більшість яких знаходиться в травному тракті. За його думкою, тривалість життя може суттєво збільшуватись, а швидкість старіння організму зменшуватись при елімінації із кишечника за допомогою антагоністично активних молочнокислих бактерій (МКБ) (наприклад, болгарської палички) гниттєвої мікрофлори і припинення всмоктування в кров її токсичних метаболітів. В 1955 роках. Л.Г. Перетц показав, що кишкова паличка здорових людей являється одним із основних представників нормальної мікрофлори і відіграє позитивну роль завдяки сильним антагоністичним властивостям по відношенню до патогенних мікробів. Він розрізняв кишкову паличку по ступені її антагоністичної активності і виділив високоактивний штам Esсherichіа coli M17, який до нашого часу являється основою для виготовлення пробіотиків. В подальшому позитивна роль нормальної мікрофлори кишечника для організму була доведена багатьма вченими [2].

Наш час вчені називають “наступаючою епохою пробіотиків”, біопрепарати широко використовуються в медицині та ветеринарії для корекції мікрофлори ШКТ. Практика застосування пробіотиків із різних штамів і видів представників індигенної мікрофлори показала в цілому іх позитивний вплив на відновлення кишкового мікробіоценозу, збільшення загальної резистентності організму.

Ще зовсім недавно спектр пробітичних продуктів обмежувався продуктами лікувально-профілактичного призначення на основі моноштамових культур біфідобактерій і Lactobacillus acidophilus і стерилізованого молока. В останні ж роки значно розширилась сфера виробництва збагачених продуктів масового призначення.

Для виготовлення пробіотиків і продуктів харчування на основі живих мікроорганізмів зараз використовуються представники різних видів(Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgasricus, Lactobacillus felventicus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus lastic, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis та ін.). Проводиться направлений відбір штамів мікроорганізмів, які повинні володіти адгезивною здатністю та антагоністичною активністю до патогенних та УПМ, не повинні пригнічувати представників нормофлори, повинні продукувати корисні для людини біологічно активні речовини [3].

Все це вимагає ретельного дослідження антагоністичних взаємовідносин між мікроорганізмами, з однієї сторони складових кишкової мікрофлори, а з іншої – складових сучасних біопрепаратів. Хоча ґрунтовні роботи з цього приводу проводились, однак, на сучасному етапі це питання потребує подальшого вивчення.

Чисельні дослідження в цій галузі стосуються, в основному, в дослідженні антагоністичної активності пробіотиків до стандартних тест-штамів. У той же час практично відсутні експерементальні дані про порівняльну характеристику сучасних пробіотиків, їх антагоністична дія на клінічні штами, збудників гострих кишкових інфекцій. Викладене вище надає актуальності проблемі взаємодії мікроорганізмів нормальної мікрофлори та пошуку методів корекції різних патологічних порушень.

В роботі було проведено дослідження пробіотичних препаратів, їх порівняльна характеристика до патогенних та умовно патогенних клінічних штамів, збудників кишкових інфекцій. Встановлено, що складові досліджених пробіотичних препаратів володіють антагоністичною активністю шляхом продукування (метаболітів) певних хімічних компонентів різної молекулярної ваги. Ті, що мають білкову природу та кодуються плазмідами, належать до бактеріоцинів. Крім того, антагоністична дія цих бактерій визначається також виділенням ними органічних кислот та низькомолекулярних метаболітів типу пептидів. Вони також мають здатність вибірково пригнічувати ріст патогенних клінічних штамів - сальмонел шигел, ентеробактерів, клебсіел, стафілококів, ешерихій, протеїв та псевдомонад. Цим визначається актуальність та наукова новизна роботи.

Мета роботи: На основі досліджень по визначенню антагоністичних властивостей біопрепаратів провести порівняльну характеристику їх дії, обгрунтувати дію біологічних препаратів до клінічних свіжовиділених та музейних штамів, стандартних тест-штамів в сучасних умовах.

Задачі дослідження:

Дослідити фізіолого-морфологічні властивості виробничих штамів Escherichia coli M17, Bacillus cereus IP5832.

Провести порівняльну характеристику антагоністичних властивостей сучасних пробіотичних препаратів.

Об`єкт дослідження: пробіотичні препарати – “Колибактерин”, “Бактисубтил”.

Предмет дослідження: культури стандартних тест-штамів мікрооганізмів, які використовуються при контролі пробіотиків, клінічні штами збудників гострих кишкових інфекцій (Shigella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococcus та ін.), та музейні колекційні штами.

Методи досліджень:

мікробіологічні методи – використанні при визначенні деяких біолого-морфологічних властивостей виробничих та клінічних штамів мікроорганізмів, для встановлення рівня антагоністичої активності бактерій із пробіотичними властивостями.

статистичні методи – застосували для математичної обробки результатів, отриманих мікробіологічним методом дослідження для визначення вирогідності виявлених змін, зв`язків між показниками.

Розділ 1. Літературний огляд

1.1 Роль бактеріальної флори кишечника людини та її фізіологічні функції

Відповідно дослідженням ВООЗ, кожен рік збільшується кількість людей, які страждають на різні патологічні стани, так званими “хворобами цивілізації”, до них відносять патологію серця і судин, рак, алергічні захворювання, гепатити різноманітної етіології, ожиріння, остеохондроз, остеопороз, діабет, артрити та ін.

Замислюючись над питанням, яка ж причина багатьох із перечислених захворювань, не можна не звернути увагу на фізіологічне значення мікрофлори людини.

Внаслідок наукових досягнень останніх років в галузі експериментальної та клінічної медичної мікробної екології різко зросла увага вчених до ідей Мечнікова про ведучу роль мікроорганізмів людини та тварин у підтримці здоров`я та виникнення різних захворювань. Встановлено, що атеросклероз, вторинні імунодефіцити, деякі новоутворення, алергічні реакції та інші захворювання в деякій мірі пов'язані з порушеннями в екосистемі “хазяїн-мікрофлора”[1].

Майже сто років тому назад І.І.Мечніков перший науково обґрунтував та привернув увагу дослідників до використання антагоністичних властивостей молочнокислих бактерій в боротьбі з гнильною мікрофлорою травного тракту. Він вважав, що всмоктування продуктів життєдіяльності гнильних мікроорганізмів, які знаходяться в кишковому тракті людини, таких як індол, фенол, скатол отруює організм, викликаючи передчасну старість. Та висунув ідею про заміну шкідливої флори кишечника на корисну, яка повинна продовжувати життя людині та вважав, що це може бути здійснено за рахунок використання молока, збродженого ацидофільними бактеріями, Bacillus bulgaricus, Lac. Delbrueckii та іншими, які можуть пригнічувати ріст патогенних мікробів. Рекомендоване ним системне вживання кисломолочних продуктів на основі болгарської палички було одним з найбільш перспективних шляхів медицини XX століття і дало поштовх для розробки ряду бактерійних препаратів, які використовуються для корекції і нормалізації мікрофлори кишечника [2,3].

Згідно сучасним уявленням, нормальна мікрофлора – сукупність корисних мікроорганізмів, які заселяють шлунково-кишковий тракт (ШКТ), та являється суттєвим фактором фізіологічного стану людини. Відповідно теорії збалансованого харчування, заселення бактеріальною флорою травного тракту – небажаний і в певній мірі шкідливий побічний ефект. Однак бактеріальна флора ШКТ не тільки не шкідлива, але й необхідна для нормального розвитку фізіологічних функцій макроорганізму, та його філогенетичний і онтогенетичний розвиток тісно пов`язаний з біоценозом мікрорганізмів.

Великий вплив має мікрофлора кишечника на структурні характеристики та функціональні особливості самого кишечника і інших органів. Не можна не переоцінити роль мікрофлори в регулюючому її впливі на секреторні і сорбційні процеси в слизистій оболонці кишечника, а також на транспортні механізми, які реалізують надходження нутрієнтів із ентерального у внутрішнє середовище організма. Встановлено, що бактеріальні ентеротоксини суттєво підсилюють кишкову проникненість. Продукти життєдіяльності бактерій кишечника, особливо біфідобактерій, лактобактерій, ентерококів та деяких інших, сприяють всмоктуванню кальцію, заліза, води, газів, вітаміну D. Цим самим можна пояснити дефіцит ряду вітамінів і мінеральних речовин у хворих із певними дисбактеріозами кишечника.

R.Freter вважав, що в захисті макрооорганізму від кишкових інфекцій є два основні механізми: місцевий клітинно-гуморальний імунітет і захисна роль нормальної мікрофлори.