Дипломная работа: Исследование соотношения в мышцах С- и Х-белков в норме и при патологии

ТТ тиофлавин Т

УФ ультрафиолет

ЭГТА этиленгликоль бис- (β-аминоэтиловый эфир N,N,N',N-тетрауксусной кислоты)

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

FnIII фибронектин-3-подобный домен

IgC2 иммуноглобулин-С2-подобный домен

PMSF фенилметилсульфонилфторид

λ длина волны

μ ионная сила


введение

Амилоидозы – большая группа конформационных заболеваний, которая характеризуется отложениями белка в виде нерастворимых фибрилл в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков (Tan & Perys, 1994; Uversky & Fink, 2004). Их накопление разрушает структуру и функционирование органов и тканей, приводя к болезни и летальному исходу. Амилоидные отложения найдены при болезни Альцгеймера, Паркинсона, Дауна, диабете второго типа, наследственной амилоидной полинейропатии, системном амилоидозе и др. (Tan & Perys, 1994; Goedert, 2001; Dobson, 2001).

Известно много белков, образующих амилоидные фибриллы, таких как тау-белок, Аβ-пептид, ацилфосфатаза, миоглобин, амилин, транстиретин и другие (Guijarroetal., 1998; Chitietal., 1999; Fandrichetal., 2001; Uversky & Fink, 2004). Несмотря на различие в белках-предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют общие свойства: β-складчатую структуру с отдельными β-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunketal., 1989; Krebsetal., 2005). Важно отметить, что белки-предшественники амилоидов претерпевают трансформацию типа "α-спираль – β-складчатость", необходимую для образования амилоидных фибрилл (Uversky & Fink, 2004).

К сожалению, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Успешное решение этих задач во многом зависит от фундаментальных знаний амилоидогенеза: выяснения свойств амилоидов разных белков, знания факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность разных клеток и т.д. В наибольшей мере это относится к мышечным амилоидозам как к наименее изученным. Амилоидные отложения найдены при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах в мышцах и кровеносных сосудах, однако их белковая природа до сих пор неизвестна.

Данная работа посвящена изучению способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы. В настоящее время известна большая группа белков семейства тайтина (тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок и другие), относящихся к саркомерным белкам поперечно-полосатых мышц позвоночных. Они связаны с миозин-содержащими (толстыми) нитями и составляют 15% от общего количества белка в саркомере. С-белок в быстрых волокнах скелетных мышц и его изоформа Х-белок в медленных волокнах (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983) располагаются на поверхности толстых нитей с периодом 43 нм (Bennettetal., 1986; Soteriouetal1., 1993), связываясь одновременно с тайтином и миозином. Тайтин является продольным элементом саркомерного цитоскелета поперечно-полосатых мышц позвоночных.

Исследования показали, что тайтин и белки его семейства могут выполнять разные функции в саркомере. Предполагается, что они играют существенную роль в миогенезе при сборке толстых нитей и формировании структуры саркомера, участвуют в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении и в процессах сигнализации. Наличие 90% β-складчатой структуры в этих белках создает возможность формирования ими амилоидов. Изучение способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы представляет большой интерес в связи с их возможным участием в развитии амилоидозов. Ранее при изучении агрегационных свойств белков, связанных в саркомере с миозиновыми нитями, было обнаружено, что один из них (Х-белок) образует in vitro спирально скрученные ленточные фибриллы (Bennett et al., 1985). Авторы указали на визуальное сходство этих структур с амилоидными фибриллами, образуемыми Аβ-пептидом в мозге при болезни Альцгеймера. Однако разные структурные параметры фибрилл Х-белка заставили авторов сомневаться в этом предположении и, возможно, поэтому тестирование их на амилоидогенность не было проведено. Эти наблюдения и высокое содержание β-складчатой структуры стимулировали наше исследование амилоидной природы агрегатов, образуемых Х-белком и другими саркомерными белками семейства тайтина.


I . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. САРКОМЕРНЫЕ ЦИТОСКЕЛЕТНЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА ТАЙТИНА

Сократительным аппаратом мышечной клетки является миофибрилла, которая состоит из наименьших сократительных единиц – саркомеров. Саркомеры расположены друг за другом вдоль оси миофибриллы. Каждый саркомер содержит упорядоченную систему цитоскелетных и сократительных белков и имеет длину 2.5–3.0 мкм (Squire, 1981; Шубникова и др. 2001). Основными сократительными белками саркомера являются миозин, актин и тайтин. Молекулы актина образуют тонкие (актиновые) нити, в состав которого входят также тропомиозин и тропонин. Толстые нити скелетных мышц кроме миозина содержат также другие белки, такие как тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок и др. (рис. 1).

Рис.1. Модифицированная схема саркомера (Gregorioetal., 1999).

1.1 Структура молекулы тайтина и его функции

Тайтин (= коннектин, титин) – гигантский эластичный белок скелетных и сердечных мышц млекопитающих (Maruyamaetal., 1977; Wangetal., 1979) с молекулярным весом более 3 МДа (Labeit & Kolmerer, 1995). Он был открыт независимо двумя группами исследователей методом ДСН-гель-электрофореза (Wangetal., 1979; Maruyamaetal., 1981). Тайтин является третьим по количеству (после актина и миозина) компонентом саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных. Молекулы тайтина длиной около 1 мкм и шириной 3–4 нм (Trinicketal., 1984; Itohetal., 1986; Naveetal., 1989; Soteriouetal., 1993; Suzukietal., 1994; Houmeidaetal., 1995; Tskhovrebova & Trinick, 1997) перекрывают половину саркомера от М-линии до Z-линии (рис. 1), простираясь через I- и А-диски саркомера, формируя третью филаментную систему в миофибриллах (Fürstetal., 1988). NH2-концы молекулы тайтина из смежных саркомеров перекрываются в Z-линии, а СООН-концы перекрываются в М-линии. На каждую половину саркомера приходится по шесть молекул тайтина, которые объединены в А-диске саркомера (Trinick 1981; Liversageetal., 2001) и, предположительно, разделяются на пары или на индивидуальные молекулы в I-диске саркомера (Funatsuetal., 1993).

Исследования последних лет показали, что этот гигантский полипептид имеет различное строение в разных зонах саркомера, что вносит свой вклад в их архитектуру и функционирование. Бóльшая часть (~90%) молекулы тайтина состоит из повторяющихся иммуноглобулин-С2-подобных (IgС2) и фибронектин-3-подобных (FnIII) доменов (Labeit & Kolmerer, 1995) с β-складчатой структурой, содержащих около ста аминокислотных остатков (Improtaetal., 1996; Muhle-Golletal., 1998) (рис. 2). Кроме этих доменов тайтин содержит уникальные последовательности, расположенные по всей длине его молекулы: киназный домен вблизи М-линии саркомера; два участка связывания с кальпаиновой протеазой (р94) в I-диске и М-линии саркомера, а также эластичные N2B, N2A и PEVK элементы в I-диске саркомера. В концевых областях молекулы тайтина расположены фосфорилируемые участки.

1.2 Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка

Предположение о присутствии белков немиозиновой природы в структуре толстых, или миозин-содержащих нитей на основании электронно-микроскопических и рентгеновских исследований высказывались давно (Draper & Hodge 1949; Franzini-Armstrong & Porter 1964; Pepe 1967; Hansonetal., 1971), однако до начала 70-х годов природа этих белков была неизвестна. С-белок, Х-белок и Н-белок были обнаружены с помощью ДСН-гель-электрофореза как минорные примеси в препаратах миозина скелетных мышц кролика (Starr & Offer, 1971). В настоящее время эти белки охарактеризованы, и их количество в саркомере составляет около 5% от массы миозина.

С-белок впервые был выделен из скелетных мышц кролика (Offeretal., 1973). Его количество составляет около 2% от массы миофибрилл и около 4% от массы толстой нити.

Показана способность сердечного С-белка фосфорилироваться разными протеинкиназами в условиях invivo и invitro (Jeacocre & England, 1980; Hartzell & Titus, 1982; Hartzell & Glass, 1984; Hartzell, 1985; Limetal., 1985; Gauteletal., 1995; Mohamedetal., 1998). Молекулярный вес С-белка скелетных мышц по данным ДСН-гель-электрофореза 135 кДа (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983), а по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующих этот белок, составляет 128.1 кДа (Weberetal., 1993). Аминокислотный состав белка характеризуется довольно высоким содержанием пролина, что коррелирует с низким содержанием α-спирали в его молекуле. Методом седиментации показано, что С-белок связывается с высоким сродством с миозином (Callaway & Bechtel, 1981; Yamamoto & Moos, 1983). Электронно-микроскопические исследования подтвердили это связывание для С-белка: он декорирует реконструируемые миозиновые нити и паракристаллы легкого меромиозина (ЛММ) invitro (Moosetal., 1975; Starr & Offer, 1978; Safer & Pepe, 1980; Фрейдина и др., 1980; Подлубная, 1981; Podlubnayaetal., 1990). Показана способность С-белка связываться с актином (Moosetal., 1976; Moosetal., 1978; Moos, 1981; Фрейдина и др., 1980) и тайтином (Koretzetal., 1993; Soteriouetal., 1993; Fürstetal., 1992; Freiburg & Gautel, 1996). При снижении ионной силы ниже физиологических значений (μ ≤ 0.1).

Х-белок содержится в грубых препаратах С-белка, выделенного из миозина хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе (Starr & Offer 1982). Был разработан метод разделения Х- и С-белков с помощью колоночной хроматографии на гидроксиапатите (Starr & Offer 1982; Starretal., 1979). Молекула Х-белка представляет собой гибкую ниточку длиной около 30–35 нм и диаметром 3–4 нм (Bennettetal., 1985). Молекулярный вес Х-белка скелетных мышц кролика по данным ДСН-гель-электрофореза составляют и 145–152 кДа (Yamamoto & Moos 1983; Starr & Offer 1983), а по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующего этот белок, составляют 126.5 кДа (Weberetal., 1993).

Аминокислотный состав характеризуется высоким содержанием пролина, что соответствует низкому (4%) содержанию α-спирали.

Н-белок выделен из скелетных мышц кролика, точнее – из грубых препаратов С-белка, хроматографией на гидроксиапатите (Starr & Offer, 1982; 1983). Он составляет 0.3–0.4% от миофибриллярной массы. Молекула Н-белка содержит одну полипептидную цепь с молекулярным весом по данным ДСН-гель-электрофореза ~ 69–74 кДа (Starr & Offer, 1983), а по данным другого метода ~ 86 кДа (Vaughanetal., 1993). Молекулярный вес Н-белка скелетных мышц цыпленка и человека по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующего этот белок, составляет 58.4 кДа и 51.9 кДа, соответственно (Vaughanetal., 1993). Аминокислотный состав Н-белка сходен с аминокислотным составом С-белка, но отличается от последнего более высоким содержанием пролина и аланина и более низким содержанием аспарагиновой кислоты, валина и лизина (Yamamoto, 1984). Молекула Н-белка содержит около 4% α-спирали (Starr & Offer, 1983). Н-белок взаимодействует с миозином и с актином (Starr & Offer, 1983).

Белки семейства тайтина могут участвовать в сборке толстых нитей и стабилизации их структуры. Известно, что С-белок, также как и тайтин (Wang & Wright, 1988), появляется в мышечной клетке на ранних стадиях миофибриллогенеза (Bahleretal., 1985). Имеются также данные о влиянии тайтина, С-белка и Х-белка на формирование миозиновых нитей invitro (Koretz, 1979; Miyahara & Noda, 1980; Koretzetal., 1982; Вихлянцев 2005). Вероятно, что С-белок (вместе с тайтином) участвует в сборке и стабилизации структуры толстых нитей. Исследования invitro показали, что Н-белок влияет на связывание С-белка с миозином (Yamamoto, 1984). Показано связывание С-белка и тайтина с актином в условиях invitro. Предполагается, что физиологическое значение этого связывания в саркомерах скелетных мышц заключается в регуляции актин-миозинового взаимодействия. В экспериментах invitro показано, что тайтин и С-белок активируют АТФазу актомиозина. Это влияние может быть обусловлено как модифицирующим действием С-белка и тайтина на миозиновый мостик, так и прямым их взаимодействием с актином (Moosetal., 1978, 1980; Moos, 1981; Muhle-Golletall., 2001; Moolman-Smooketal., 2002; Squireetal., 2003). Х-белок и Н-белок также могут быть вовлечены в процесс мышечного сокращения, ингибируя АТФ-азную активность актомиозина (Yamamoto, 1984, Вихлянцев, 2005). В поддержку предположения о регуляторной роли С-белка в сократительной активности являются данные о фосфорилировании С-белка сердечной мышцы. В ранних исследованиях было показано, что уровень фосфорилирования С-белка в интактном сердце коррелирует со скоростью релаксации мышцы (Hartzell & Glass, 1984). Invitro фосфорилирование сердечного С-белка приводило к снижению его активирующего эффекта на АТФазу АМ (Hartzell, 1985). На основе полученных данных автором было сделано предположение, что С-белок участвует в механизме расслабления сердечной мышцы. Однако результаты дальнейших исследований показали, что фосфорилирование С-белка модулирует процесс сокращения сердечной мышцы, увеличивая доступность миозиновых головок к актину (Weisberg & Winegrad, 1996, 1998; Kunstetal., 2000; McClellanetal., 2001; Kulikovskayaetal., 2003; McClellanetal., 2004; Flashmanetal., 2004). Действительно, согласно последним данным фосфорилирование сердечного С-белка приводит к усилению сократительной активности мышцы (Stelzeretal., 2006).

1.3. Белки семейства тайтина в норме, при адаптации и патологии

Структурно-функциональные свойства белков семейства тайтина в норме описаны выше. Эти белки являются важными компонентами сократительного аппарата мышечной клетки, участвуя в построении и стабилизации структуры саркомера. Влияние белков семейства тайтина на АТФазу актомиозина указывает на их важную регуляторную функцию в норме.

К-во Просмотров: 199
Бесплатно скачать Дипломная работа: Исследование соотношения в мышцах С- и Х-белков в норме и при патологии