В настоящее время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального калиевого канала и его физиологическая роль [Миронова и др., 1996 (I, II); Paucek et al., 1992; Inoue et al., 1991; Garlid et al., 1997; Mironova et al., 1999; 2004]. Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос, поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [Grover et al., 1992; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоК_АТФ , являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Недавно в лаборатории проф. Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоК_АТФ – уридин-5’-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004; Негода А.Е., 2004]. Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как активатора К⁺ -канала, и, следовательно, кардиопротектора, до настоящего времени не было изучено на животных.

Помимо важной роли митоК_АТФ в защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают участие активации канала в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al., 2003]. Однако прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных исследований.

К настоящему времени нами разработана рабочая модель структуры и регуляции канала, в соответствии с которой митоК_АТФ канал состоит из двух субъединиц – канальной (с молекулярной массой 55 кДа) и регуляторной (с молекулярной массой 63 кДа). Однако вопрос о структуре канала и возможной гомологии с другими белками пока остается открытым. Изучение структуры митоК_АТФ позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне.

В связи с этим, целью данной работы было: изучить структурную организацию митоК_АТФ канала, кардиопротекторное действие УДФ при ишемии миокарда, исследовать параметры функционирования митоК_АТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию.

Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать параметры функционирования митоК_АТФ у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода.

2) Определить гомологию структуры исследуемого белка с м.м. 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков.

3) Получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-ингибируемые К⁺ каналы.

4) Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных МХ с использованием полученных антител (АТ) с целью доказательства принадлежности белка с м.м. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К⁺ в МХ.

5) Исследовать иммунолокализацию МитоК_АТФ канала на срезе гепатоцитов и кардиомиоцитах при помощи электронной микроскопии

Глава 1. Обзор литературы

1.2 Системы транспорта калия в митохондриях

1.1.1 Транспорт калия в митохондрии

Транспорт К⁺ в митохондриях (МХ) имеет большое функциональное значение, так как концентрация К⁺ в цитоплазме значительно превышает концентрацию других катионов, и появление любой неконтролируемой проницаемости митохондриальной мембраны для К⁺ может представлять угрозу осмотической целостности и функциональной интегральности МХ [Brierley et al., 1983]. МХ занимают 40% внутриклеточного пространства в сердечной клетке и до 20% - в клетке печени и по данным [Rottenberg, 1973], в свободном состоянии в матриксе МХ содержится 95 нмоль К⁺ /мг белка МХ, в слабосвязанном состоянии – 45 нмоль и в прочносвязанном – 5 нмоль. Концентрация свободного калия в цитоплазме составляет 90-120 нмоль.

Хемиосмотическая теория Митчела включает четыре постулата, последние два из которых имеют отношение к системе транспорта катионов. Согласно этим двум постулатам, внутренняя мембрана МХ: а) непроницаема для Н⁺ , ОН^- и всех прочих ионов; б) содержит ряд белков-переносчиков, осуществляющих транспорт неорганических ионов и необходимых метаболитов. Таким образом, по Митчелу, внутренняя мембрана МХ непроницаема для катионов и анионов. Однако из-за большого электрохимического потенциала [Δφ] (~ –200 мВ с матриксной стороны) одновалентные катионы (К⁺ и Na⁺ ) могут диффундировать через липидный бислой. Проблема такой утечки будет наиболее актуальна для ионов К⁺ , как основного катиона цитозоля и матрикса, хотя скорость такой диффузии будет не велика.

Что касается специфических систем транспорта, то было установлено, что в МХ существуют системы: 1) электрогенного входа калия и 2) К⁺ /Н⁺ -антипортер [Chavez et al., 1977; Diwan, 1981; Garlid, 1980], о существовании которого говорил Митчел [Mitchell and Moyle, 1969].

В работах с использованием радиоактивного калия (⁴² К⁺ ) было показано, что активный транспорт К⁺ в МХ осуществляется электрогенно и что существует специфическая К⁺ -транспортирующая система, функционирующая подобно ионофорам, катализирующим унипорт калия [Gamble, 1957, 1962; Judan et al., 1965; Rottenberg, 1973; Chavez et al., 1977].

В качестве системы электрогенного транспорта К⁺ в МХ предлагались следующие варианты: 1) подвижный переносчик или канал [Jonston and Griddle, 1978; Panov et al., 1980; Jung et al., 1982]; 2) электродиффузное движение через гидрофильные поры и 3) вход калия с участием белковых транспортных систем, которые помимо своей основной функции, могут осуществлять транспорт К⁺ [Brierly, 1980, 1983].

1.1.3 Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в МХ

В настоящее время в литературе в качестве транспортных систем, осуществляющих электрогенный транспорт калия в МХ, рассматриваются следующие структуры: 1) АТФ/АДФ-антипортер или аденинуклеотидтранслоказа (АНТ) [Panovetal., 1980; LeQuocetal., 1988] и 2) специфические белки, которые образуют во внутренней мембране МХ канал для электрогенного входа ионов калия [Миронова и др., 1981; Diwanetal., 1988; Pauceketa., 1992]. В первом случае предполагается, что АНТ, помимо основных функций, может работать как система электрофоретического транспорта ионов калия в МХ при действии на МХ субмикромолярных концентраций ионов кальция, и как неспецифическая пора для низкомолекулярных соединений при повреждении МХ высокими концентрациями Ca²⁺ [JungandBrierley, 1981; 1982; Halestrapetal., 1986].

Что касается специфических белков, следует отметить, что в лаборатории Мироновой в 1981 г. методом водно-этанольной экстракции из МХ сердца быка был выделен и очищен белок с м.м. 55 кДа, который при реконструкции в бислойные липидные мембраны (БЛМ) образовывал К⁺ -селективные каналы проводимости [Миронова и др., 1981], которые, как было показано позднее, ингибируются физиологической концентрацией АТФ и глибенкламидом, и относятся к семейству АТФ-чувствительных калиевых каналов [Миронова и др., 1996 (I); Mironovaetal., 1999]. Структура митохондриального К_АТФ канала не определена [Pauceketal., 1992].

Диван с соавторами, используя детергент Тритон Х-100, из МХ мембраны печени крыс выделили белок с м.м. 53 кДа [Diwanetal., 1988]. Реконструировав его в липосомы, авторы показали, что этот белок также обладает свойствами, характерными для К⁺ унипортера.

Известно, что в МХ помимо системы электрогеннного входа К⁺ существует система электронейтрального выхода К⁺ в обмен на Н⁺ [GarlidandPaucek, 2003]. При этом внешняя МХ мембрана не препятствует дальнейшему обмену небольшими ионами с цитоплазмой.

Система электрогенного входа калия и электронейтрального К⁺ /Н⁺ -обменника образуют К⁺ цикл МХ (Рис.1).

Рис. 1. МХ калиевый цикл по Garlid and Paucek, 2003. ЭТЦ – электрон-транспортная цепь; ММП – межмембранное пространство; Фн – неорганический фосфат.

Электрогенный выброс протонов электрон-транспортной системой генерирует мембранный потенциал, который, в свою очередь, стимулирует диффузию К⁺ в матрикс МХ («утечка калия» или К⁺ leak) и вход иона, опосредованный неким специфическим калиевым каналом. Такой обмен Н⁺ на К⁺ подщелачивает матрикс, вызывая вход фосфата по электронейтральному Фн-Н⁺ симпортеру (Фн – неорганический фосфат) (Рис.1).

Вход К⁺ сопровождается накоплением осмотически облигатной воды, что проявляется в набухании МХ. Излишнее их набухание может угрожать целостности этих органелл, следовательно, избыток К⁺ необходимо удалять. Эту функцию выполняет белок с м.м. 82 кДа - К⁺ /Н⁺ -антипортер [BrierleyG., 1976; GarlidK., etal., 1980; 1988]. Следует отметить, что вход К⁺ путем диффузии слишком мал, чтобы существенно влиять на изменение объема матрикса МХ. Интенсивный вход калия в МХ обеспечивается специфическими белками, осуществляющими электрофоретический вход К⁺ в МХ [MironovaG., 1981; DiwanJ., etal., 1988; Pauceketal., 1992].

1.1.3 Физиологическое значение транспорта калия в МХ

Предполагается, что основное физиологическое значение систем транспорта К⁺ в МХ связано с регуляцией объема МХ матрикса. Объем МХ определяется калиевыми токами через внутреннюю мембрану. Когда вход и выход К⁺ находятся в равновесии, калиевые потоки определяются электронейтральным током анионов и осмотически облигатной воды [Garlid, 1988]. Так как концентрация ионов калия в матриксе и в цитоплазме практически одинаковая, транспорт калия мало влияет на матриксную концентрацию калия, но может иметь большое влияние на объем МХ. Небольшое нескомпенсированное увеличение входа К⁺ в МХ может удваивать их объем в течение 1-2 минут [Garlid, 1979]. В свою очередь, увеличение матриксного объема стимулирует активность дыхательной цепи, что было показано на МХ сердца и печени [NicholsandLindberg, 1972; Halestrap, 1989]. Окисление жирных кислот также чувствительно к изменению объема матрикса [Halestrap, 1987].

Увеличение в МХ концентрации К⁺ и последующее изменение их объема имеет значение и в регуляции митохондриальных процессов у зимоспящих животных [Fedotchevaetal., 1985; Бакеева и Брустовецкий, 1993], а также при адаптации животных к холоду [NedergraardandCannon, 1987]. В ряде работ установлено, что invivo, гормон, участвующий в регуляции теплопродукции (тироксин), активирует системы электрогенного транспорта К⁺ , вызывая низкоамплитудное набухание МХ [Halestrap, 1987; ShearsanBrouk, 1980]. В нашей лаборатории, было показано, что активность системы электрогенного транспорта ионов калия прямо коррелирует с интенсивностью термогенеза [Федотчева и др., 1984; Миронова и др., 1986], что непосредственно связано с увеличением содержания ионов калия в МХ бурой жировой ткани и печени [Скарга, 1994]. Активацию транспорта калия при выходе животного из спячки, связывают с активацией футильного цикла К⁺ в МХ, приводящей к увеличению теплопродукции, до начала синтеза АТФ в МХ [Миронова и др., 1986].

Обнаружено также, что митоК_АТФ канал играет существенную роль в нормальной физиологии миокарда, регулируя объем митохондрий и продукцию активных форм кислорода (АФК) [Garlidetal., 2003a].

В последнее время интерес ученых к митоК_АТФ каналу вызван обнаружением его роли в защите сердца от инфаркта. Исследования были стимулированы открытием феномена кардиопротекторного действия прерывистой гипоксии, приводящей к активации митоК_АТФ [Murryetal., 1986]. Установлено, что фармакологические активаторы митоК_АТФ канала предохраняют сердце от ишемических повреждений [Garlidetal., 1997].

1.1.4 АТФ-ингибируемые калий-транспортирующие каналы

К⁺ каналы, активность которых ингибируется физиологическими концентрациями АТФ впервые были обнаружены в цитоплазматической мембране кардиомиоцитов [Noma, 1983]. С тех пор, аналогичные каналы были найдены в β клетках поджелудочной железы [DunneandPetersen, 1991], в скелетной мускулатуре [Spruceetal., 1985; Wolletal., 1989], в нервных клетках [Jonasetal., 1990] и гладких мышцах [Standenetal., 1989]. Активность АТФ-чувствительных калиевых каналов (К_АТФ каналов) связана с уровнем биоэнергетического метаболизма клетки (концентрацией АТФ) и электрическими свойствами возбудимости плазматической мембраны. Микромолярные концентрации АТФ и сульфонилмочевины – класс гипогликемических соединений, использующихся при лечении диабета, регулируют активность всех представителей семейства К_АТФ каналов [Ashcroftetal., 1989]. Концентрация кальция и изменение мембранного потенциала практически не влияют на активность этих каналов [AshcroftandAshcroft, 1990]. В то же время, в кортикальных и гипоталамических нейронах К_АТФ каналы [Ashfordetal., 1989; Ashfordetal., 1988] менее чувствительны к АТФ (для их ингибирования нужны миллимолярные концентрации). В эпителиальных клетках (назальные полипы) также были обнаружены К_АТФ каналы с низкой чувствительностью к АТФ, но активирующиеся микромолярными концентрациями Ca²⁺ [Kunzelmannetal., 1989]. При этом, все вышеперечисленные каналы высокоселективны для ионов К⁺ .

В МХ мембране также были обнаружены АТФ-зависимые К⁺ каналы. Так, в 1991 г. впервые с использованием метода петч-кламп [Inoueetal., 1991] на митопластах было показано, что во внутренней мембране МХ присутствуют высокоселективные по К⁺ каналы с невысокой проводимостью. Обнаружено, что каналы могут обратимо ингибироваться АТФ, а так же 4-аминопиридином и специфическим ингибитором цитоплазматического К_АТФ канала – глибенкламидом с матриксной стороны [Inoueetal., 1991]. Однако, как было сказано выше, еще в 1981 году в лаборатории проф. Мироновой во внутренней мембране МХ был обнаружен К⁺ -селективный АТФ-ингибируемый канал [Миронова и др., 1981; 1996; 1997; 1999], принадлежащий к семейству К_АТФ каналов [Pauceketal., 1992]. Данный канал имеет те же характеристики проводимости, что и канал, обнаруженный методом пэтч-кламп. В настоящее время он интенсивно изучается, поскольку играет важную роль в функционировании клетки. Однако вопрос о его структуре требует дальнейших исследований.

1.2 АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны

К настоящему времени К_АТФ каналах плазматической мембраны хорошо изучены. Изначально их классификация велась по величине проводимости одиночных каналов [AshcroftandAshcroft, 1990], а позднее, с развитием молекулярно-биологических методик, по аминокислотному составу белковой молекулы канала [Yokoshikietal., 1998].

1.2.1 Структурная организация цитоплазматического АТФ-зависимого калиевого канала