Дипломная работа: Участие митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала в адаптации животного к гипоксическому состоянию
10 мкл маркера (0.1 мг/мл) + 120 мкл SLB (1)
Приготовление кумасси: 600 мгкумасси голубого; 200 мл 96% этанола; 40 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 200 мл воды.
Концентрированный буфер для форезной камеры: 7.6 гTris-HCl + 36 г глицина доводили дистиллированной водой до 800 мл и рН 8.3-8.8. После этого в буфер добавляли 2.5 г додецилсульфата натрия.
Рабочий буфер для форезной камеры: Разводили концентрированный буфер в 5 раз.
Буфер для разделяющего геля: Tris-HCl 1.5 M (9.1 г на 50 мл воды доводили до рН 8.8), затем добавляли 200 мг SDS на 50 мл.
Буфер для концентрирующего геля: Tris-HCl0.5 М (3 г на 50 мл). После доведения рН до 6.8 добавляли 200 мг SDS на 50 мл.
40% - бис-акриламид (60 мл): акриламид 23.34г.; бис-акриламид 0.64г.
Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 2.
Таблица 2. Приготовление гелей для SDS-электрофореза в ПААГ.
| Вещество | Разделяющий 10 % (20 мл) | Концентрирующий 5% (5 мл) |
| 40% бис-акриламид | 5 мл | 0,72 мл |
| Буфер для геля | 5 мл | 1,6 мл |
| Вода | 9,3 мл | 3,95 мл |
| Персульфат аммония (1%) | 0,7 мл | 0,6 мл |
| TEMED* | 10 мкл | 15 мкл |
П р и м е ч а н и е: TEMED вносится непосредственно перед заливанием геля.
После полимеризации гелей пробы (в т.ч. метчик) кипятили на водяной бане в течение 5 минут и горячими наносили в карманчики геля. Маркер (рабочий) наносили в объеме 1/6 от объема проб.
Электрофорез проводили при силе тока 20 мА на одну пластинку. Когда пробы входили в разделяющий гель, силу тока увеличивали в 2 раза и оставляли до тех пор, пока краска не доходила до конца геля (1.5-2 часа).
Красили кумасси примерно 15 мин. Затем отмывали 7.5 % уксусной кислотой в течение ночи на шейкере. Если было необходимо, окрашивали серебрением (таблица 3).
Таблица 3. Окрашивание серебрением (Silverstaining, Shevchenkoatal., 1996)
| Реагент | Экспозиция |
| 50 % метанол + 10% уксусная кислота | 2*20 мин |
| 20% этанол | 10 мин |
| Вода | 10 мин |
| Тиосульфат натрия (0.2 г/л) | 1 мин |
| Вода | 2*20 сек |
| Нитрат серебра (2 г/л) | 30 мин |
| Вода | 20 сек |
| Проявитель: карбонат натрия (30 г/л); 37% формалин 1.4 мг/л; тиосульфат натрия 10 мг/л | Пока не проявится (около 20 мин) |
| 1% уксусная кислота | Минимум 20 мин |
Фракции, в которых при электрофорезе обнаружен белок с Mr 55 кДа, диализовали против 5 мМ Tris-HCl, pH 7.4.
Диализат наносили на вторую колонку с DEAE-целлюлозой (высота 1 см, объем 1 мл).
Смывали белки таким же градиентом по два объема колонки.
Фракции после первой и второй колонки проверяли на приборе для определения проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ).
2.1.6. Определение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ)
Электрическая часть прибора для измерения проводимости бислойных липидных мембран представляет собой амперметр, измеряющий силу тока при определенной разности потенциалов между электродами. Сила тока зависит от проницаемости (сопротивления) мембраны, разделяющей раствор электролита в кювете. Исходя из этого, можно определить проводимость мембраны (проводимость = 1/ сопротивление).
Проводимость билипидного слоя очень близка к нулю (10-12 пСм) при умеренном напряжении. Абсолютное значение напряжения более 150 мВ «рвет» билипидный слой.
Проводимость отличная от нуля определяется белками, встроенными в билипидный слой.
Проводимость нелинейно зависит от напряжения (в случае БЛМ), поэтому определяется проводимость при различных напряжениях.
Подготовка кювет: до и после работы кюветы отмывали детергентами, затем 10-15 минут споласкивали в струе воды (в стакане). Промывали дистиллятом, протирали спиртом, промывали дистиллятом от спирта. Ставили сушиться. Когда кюветы высыхали, смазывали отверстие в меньшей кювете липидами снаружи и внутри и давали высохнуть. Вставляли меньшую кювету в большую. Наливали в каждую кювету по 1 мл среды.
Среда для БЛМ: 3 MKCl; 20 мМ Tris, pH 7.4.
Приготовление липидов: 20 мкл общих липидов мозга и 26 мкл кардиолипина (Blightetal., 1959). Смесь близка по составу к митохондриальным липидам.
Затем эту смесь сушили аргоном, чтобы испарился хлороформ и метанол.
В пробирку с высушенными липидами добавляли 80 мкл н-декана, чтобы растворить липиды перемешивали.
Работа на приборе: наливали в каждую кювету по 800 мкл буфера; вставляли два электрода в кюветы; включали приборы; наносили липиды на отверстие в меньшей кювете, используя микроскоп. Ждали, пока цветная (полислойная) мембрана станет черной (бислойной).
В одну из кювет (обычно транс-) добавляли необходимое количество белка, а в другую (цис-) такое же количество среды для БЛМ, причем с расчетом, чтобы содержание KCl в