Контрольная работа: Корь, симптомы и лечение
б. Глоточное отделяемое. Больного просят прополоскать горло несколькими мл обезжиренного молока, которое затем собирают в стерильный флакон. После добавления пенициллина и стрептомицина (по 500 ЕД/мл) пробу центрифугируют 35 минут при 1500 об/мин и затем вносят по 0,2—0,5 мл в 2—3 культуры клеток.
в. Секрет конъюнктивы. Осторожно протирают конъюнктиву ватным тампоном, который затем обрабатывают, как описано выше.
г. Моча. Пробу собирают в стерильный сосуд, избегая посторонней контаминации. Доводят рН до 7,0—7,2 3% раствором двууглекислого натрия и добавляют пенициллин и стрептомицин (по 200 ЕД/мл). Всю собранную мочу центрифугируют 30 минут при 3000 об/мин и 4°. Осадок ресуспендируют в 1—2 мл культуральной среды и вносят по 0,3 мл в 2—3 пробирки с культурой клеток.
2. Культуры клеток. Для выделения вируса используют только первичные культуры клеток человека или обезьян. Культуры трипсинизированных клеток почек человека, выращенные в наклонном положении, или вертикальные культуры клеток амниона человека имеют преимущество перед культурами клеток обезьян макак резусов и циномольгусов, патас и бабуинов, так как клетки человека обычно не контаминированы спонтанными вирусами.
3. Период наблюдения. В первичных культурах клеток цитопатический эффект проявляется обычно не раньше 5—10-го дня после заражения. Наблюдать культуры нужно не менее 30 дней. Один слепой пассаж может помочь обнаружить вирус при его очень низком исходном титре.
4. Идентификация вируса. Появление многоядерных гигантских клеток и постепенное разрушение клеточного слоя служит указанием на присутствие вируса. Его идентификация включает исследование окрашенных препаратов культуры для обнаружения описанных выше цитологических изменений и реакцию нейтрализации, при постановке которой используют иммунную к вирусу кори и нормальную сыворотки.
C. Серологическая диагностика
1. Реакция нейтрализации. Реакцию нейтрализации можно проводить на белых мышах-сосунках, используя адаптированный штамм вируса.
а. Типы клеточных культур. Для проведения реакции нейтрализации лучше использовать перевиваемые клеточные линии, так как они более чувствительны к адаптированному вирусу кори, чем первичные культуры. Перевиваемые линии клеток человека и обезьян лишь немногим различаются в чувствительности к коревому вирусу. Другие клеточные линии, обладающие равной стабильностью и чувствительностью к вирусу, также пригодны для работы.
б. Выбор вируса. В качестве стандартного штамма можно рекомендовать штамм Edmonstonна уровне относительно небольшого числа культуральных пассажей. При использовании других штаммов рекомендуется отбирать те, которые имеют одинаковый инфекционный титр со стандартным вирусом в аналогичных культурах ткани.
в. Выбор рабочей дозы вируса. В реакции нейтрализации используют обычно 100 ТЦД50 вируса, рассчитанных по данным титрования в соответствующей культуре клеток. Результаты титрования варьируют в зависимости от времени учета. Поэтому для используемого типа культур важно определить время, в течение которого цитопатогенность вируса выявляется полностью. В противном случае рабочая доза вируса может быть избыточной, а титры антител в исследуемых сыворотках окажутся неестественно низкими.
г. Титрование суспензии вируса. Основной вирусной суспензией служит жидкая фаза инфицированных культур, которую хранят при —70°. Из основной суспензии готовят разведения на культуральной среде. Каждое разведение вносят в 3—5 пробирок с культурой ткани, помещают их в термостат (37°) и периодически просматривают, следя за появлением цитопатических изменений. Титр рассчитывают по методу Кербера и выражают как lgТЦД50 в 1 мл или в 0,1 мл.
д. Сыворотки. Берут 5 мл крови, соблюдая предосторожности, чтобы избежать гемолиза, так как сыворотка может потребоваться для реакции связывания комплемента. Кровь оставляют в пробирке до образования сгустка, сыворотку отделяют и инактивируют 30 минут при 56°. Разведения сыворотки готовят на растворе Хэнкса.
Постановка реакции. Для большей точности можно использовать по 5 пробирок культуры на каждое разведение сыворотки. При обычной работе, в частности для определения диагностически значимого подъема титра антител, достаточно 2—3 пробирок. Исходную суспензию вируса разводят культуральной средой до концентрации 100 ТЦД50 в 0,1 мл. Это разведение вируса добавляют в равном объеме к разведениям сыворотки: смеси выдерживают час при 4°, после чего вводят каждую из них в 2—5 пробирок по 0,2 мл и помещают в термостат (37°). Для контроля титра вируса в исходной суспензии готовят три ее разведения, содержащие 100,10 и 1 ТЦД50 в 0,2 мл, заражают каждым из них группу пробирочных культур по 0,2 мл на пробирку и помещают их в термостат вместе с основным опытом. Для контроля чувствительности опыта включают лабораторную стандартную иммунную сыворотку, прошедшую сравнение с эталонной сывороткой.
Интерпретация результатов и их диагностическое значение. При помощи реакции нейтрализации можно получить подтверждение клинического диагноза или установить наличие инфекции в прошлом и невосприимчивость к кори в момент обследования. Для подтверждения диагноза одновременно исследуют сыворотку, взятую в острой фазе болезни, и сыворотку, полученную в стадии реконвалесценции. Появление антител или 4-кратное (и выше) нарастание их титра рассматривают как подтверждение коревой инфекции. Обнаружение вируснейтрализующих антител в любом титре можно считать подтверждением прошлой инфекции, а также невосприимчивости к заражению в период исследования. Наблюдения показывают, что лица даже со следами антител не заболевают при контакте с больными. В нормальном организме инфекция вирусом кори, как правило, вызывает быстрое образование антител.
2. Реакция связывания комплемента.
Методы проведения реакции при кори не отличаются существенно от применяемых с другими вирусными антигенами. Реакция дает вполне удовлетворительные и воспроизводимые результаты при постановке в пробирках, микрообъемах или капельным методом.
а. Приготовление антигена. Антигены можно готовить на многих типах клеточных культур — первичных культурах клеток почек человека, обезьян (резус и циномольгус) и собак, перевиваемых линиях клеток приматов. В качестве источника для получения антигена обычно используют жидкую фазу инфицированных культур или смесь ее с экстрактом инфицированных клеток. Антиген накапливается медленно, поэтому культуры следует тщательно поддерживать некоторое время после широкого распространения цитопатического эффекта в клеточном слое.
Обычно рабочим правилом является проведение сбора материала для антигена не ранее 7 дней после основательного развития цитопатического эффекта. Чтобы увеличить выработку антигена, культуры заражают максимально возможной дозой вируса. Некоторое повышение титра антигена достигают 3-кратным попеременным замораживанием и оттаиванием культур перед сбором жидкости в смеси сухого льда и спирта. Это способствует освобождению вирусного антигена из клеток. Собранный и смешанный материал прогревают 30 минут при 56° для инактивации вируса и центрифугируют 15 минут при 2000 об/мин. На-досадочную жидкость (антиген) разливают в плотно закрывающиеся флакончики. При —15° антиген можно хранить в течение многих месяцев.
б.Сыворотки. Сыворотки людей инактивируют 30 минут при 56° исразу же исследуют или хранят при 15°-20°. Сыворотки обезьян могут приобретать некоторую степень антикомплементарности.
в. Техника реакции связывания комплемента при кори.
Стандартный метод проведения реакции связывания комплемента в пробирках является модификацией метода Колмера. Используют 2 единицы комплемента, связывание проводят при 5° в течение 16—18 часов. Антигены и сыворотки берут в объемах по 0,25 мл, комплемент и взвесь сенсибилизированных эритроцитов — по 0,5 мл. Антиген готовят из штамма Edmonstonна относительно низком пассажном уровне, выращивание проводят на перевиваемых клетках FLамниона человека. Титр антигена соответствует наибольшему разведению, связывающему комплемент в присутствии 4 единиц антител, и составляет обычно 1:4. Титр антител соответствует наибольшему из двукратных разведений сыворотки, дающему связывание на 4+ или 3+.
3. Реакция торможения гемагглютинации.
а. Приготовление гемагглютинина. Клеточные культуры, пригодные для получения гемагглютинина вируса кори, включают перевиваемые линии клеток KB, клеток Lu106—легкого эмбриона человека, первичные культуры почечных клеток обезьян бабуинов, почечных клеток собак и ряд других перевиваемых линий и первичных культур. Выработка гемагглютинина в клетках почек собак протекает медленнее, чем в клетках перевиваемых линий, однако его конечные концентрации вполне сравнимы с получаемыми в других типах культур, а иногда оказываются более высокими. Согласно имеющимся данным, высокие инфекционные титры соответствуют тем клеточным системам, где размножение вируса достигает наибольших уровней.
В период выработки гемагглютинина применяют разнообразные поддерживающие среды. Для клеток KBпригодна среда 199 с 5% куриной или телячьей сыворотки; для культур ткани почек собак — среда с коровьей амниотической жидкостью или среда, состоящая из 0,5% гидролизата лактальбумина и 2% инактивированной телячьей сыворотки в растворе Эрла.
Культуры заражают неразведенной вирусной суспензией высокого титра и инкубируют в термостате до тех пор, пока цитопатический эффект не проявится в 50—100% клеток. После этого культуры трижды попеременно замораживают и оттаивают, смешивают полученную жидкость и удаляют взвешенные частицы центрифугированием 20 минут ар и 1500 об/мин.
Гемагглютинационный титр такого препарата обычно низок, поэтому проводят дополнительную концентрацию антигена. Один из применяемых методов концентрации заключается в добавлении к жидкости 0,06% желатина, центрифугировании 90 минут при 30000 об/мин, удалении 9/10 надосадочной жидкости и ресуспендировании осадка в оставшейся 1/10.
Метод, предложенный Norrby, позволяет получить гемагглютинин достаточно высоких титров, пригодный для практического использования без дополнительной концентрации. Культуры перевиваемых клеток легкого эмбриона человека (линия Lu106) или первичные культуры клеток собачьих почек заражают неразведенным вирусом (штамм Edmonston) и инкубируют при 33°. Среду сменяют через 2—3 дня. Когда все (или почти все) клетки окажутся пораженными, культуры подвергают троекратному попеременному замораживанию и оттаиванию и собирают культуральную жидкость. Добавляют Твин 80 в концентрации 0,125% при постоянном помешивании на холоде (можно при комнатной температуре). Затем на холоде при постоянном помешивании добавляют эфир (половину объема обрабатываемого материала) и продолжают перемешивание 15 минут. Центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин, отбирают водную фазу и удаляют из нее остатки эфира пропусканием газообразного азота. Такая обработка препаратов, полученных на клетках Lu106, увеличивает титр гемагглютинина в 4—8 раз, а полученных на клетках почек собак-в 8-32 раза. Без добавления Твина 80 обработка эфиром снижает титр гемагглютинина.
б. Сыворотки. Проводят инактивацию сывороток 30 минут при 56°. Так как некоторые сыворотки человека и различных животных (например, кроликов) содержат агглютинины к эритроцитам обезьян, рекомендуется провести адсорбцию каждой сыворотки при 4° в течение ночи с равным объемом 50% взвеси обезьяньих эритроцитов, которые затем удаляют центрифугированием или осторожным отсасыванием отстоявшейся за ночь сыворотки.