Контрольная работа: Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК
Конечные концентрации На 1 л
10 мМ трис-HCl10мл 1М раствора
1 М NaCI58,44 г.
Проавтоклавируйте.
7. 0,1 М ФМСФ Раствор используется для инактивации протеиназы К. Ресуспендируйте 17,5 мгФМСФ в1мл изопропанола.
Помните, что раствор нестабилен, поэтому его надо использовать свежим и готовить перед употреблением. ФМСФочень токсичен.
8.PSG
Этот раствор используется для отмывки простейших перед лизисом. Конечные концентрации На 1 л
75 мМ Na-фосфатный буфер 75 мл 1 М раствора
65 мМ NaCI13 мл 3 М раствора
10% глюкоза 100 г.
Проавтоклавируйте.
| Организм | Концентрация клеток в 100 мкл блок-вставки | Нагрузка на дорожку при форезе |
| Trypanosoma brucei Plasmodium falciparum Giardia lambia Leishmania | 2х10х10 1Х102х10 |
1/16 1/8 1/10 1/16 |
Известно, что хромосомная ДНК из-за больших размеров молекулы чрезвычайно чувствительна к воздействию нуклеаз. В связи с этим необходимо принять за правило предварительно обрабатывать все растворы, контактирующие с ДНК. Растворы следует разлить на небольшие порции и простерилизовать. Стерильными должны быть и посуда, и оборудование. Для переноса образцов из вставок или из трубочек можно использовать изогнутую стеклянную палочку, простерилизованную в спирте и в пламени горелки. При работе с образцами ДНК нельзя пользоваться никакими приспособлениями, содержащими металлические детали, в частности из нержавеющей стали, а также шпателями и бритвенными лезвиями. ДНК прочно связывается со многими бивалентными металлами и контакт с ними обычно приводит к появлению разрывов в молекуле ДНК.
2. Приготовление вставок с образцами ДНК простейших
Свободно живущие простейшие могут быть прямо использованы для приготовления вставок с препаратами ДНК. Их можно отделить от культуральной среды центрифугированием. Перед приготовлением вставок внутриклеточных паразитов выделяют из клеток крови или других хозяйских клеток. Эритроциты можно лизировать, как указано в табл. 3. В некоторых случаях трипаносом выделяли из различных клеточных элементов с помощью ионно-обменной хроматографии на ДЕАЕ-носителе.
2.1 Выделение ДНК из культивируемых клеток и лимфоцитов
Процедуры получения ДНК из культивируемых клеток и из простейших имеют много общего. Для рестрикционного картирования необходимо использовать клеточные линии только с нормальным стабильным геномом. Например, клетки HeLa очень удобны для культивирования, но содержат большое количество хромосомных перестроек и имеют разную плоидность. Один миллион диплоидных клеток должен содержать примерно 6,6 мкг ДНК, что соответствует размерам генома 6х10 нуклеотидных пар. Поскольку несинхронизированные клеточные культуры обычно представляют собой смесь диплоидных, тетраплоидных и промежуточных состояний, мы используем для работы 1х10клеток, считая, что они содержат примерно 10 мкг ДНК.
Процедуру, описанную в табл. 3, использовали также для получения интактных хромосом из различных клеточных линий насекомых. При этом концентрация клеток должна быть пересчитана в соответствии с меньшими размерами генома.
Методика выделения ДНК из лимфоцитов существенно близка используемой для культивируемых клеток, если лимфоциты свободны от примеси эритроцитов. Эритроциты могут быть или лизированы), или удалены с помощью центрифугирования в градиенте фиколла или перколла. Эти методы описаны в табл. 3.
2.2 Выделение ДНК из клеток прокариот
Методика выделения ДНК из клеток Е. coliпредставлена в табл. 4. Именно эта методика была с успехом использована для получения интактной хромосомной ДНК широкого набора бактерий и архебактерий, включая Salmonella, Legionella, Mycobacterium, Haemophilus, Bacillus, Streptomyces, Halobacteriumи некоторые другие быстрорастущие, сопутствовавшие им. Размеры хромосом у этих бактерий варьируют в пределах от 1 до 20хЮ нуклеотидных пар, количество хромосом на одну клетку также может изменяться от 1 до 5 в зависимости от условий культивирования. Таким образом, в предварительные эксперименты необходимо включить подсчет клеток в широком диапазоне.
В некоторых случаях могут оказаться необходимыми небольшие изменения в методике. Например, в растворе Pett IV, когда его использовали для обработки Halobacterium, концентрацию NaCl пришлось увеличить до 0,5 М, чтобы предотвратить преждевременный лизис клеток.
Прием, описанный в табл. 4, предназначен для синхронизации репликативных вилок, которая достигается инкубацией клеток в хлорамфениколе в течение 1 ч непосредственно перед сбором. Обработка хлорамфениколом позволяет закончиться уже начатым репликативным процессам, но предотвращает запуск новых. Препараты ДНК можно получить и из несинхронизированных культур. Однако необходимо помнить, что области хромосом около точек конца репликации могут быть недопредставлены в некоторых препаратах. Иногда это не имеет значения, но не всегда. Так, например, интенсивность окрашивания бромидом этидия зависит от молекулярного веса. Таким образом, хромосомную ДНК из области терминации репликации будет непросто выявить с помощью этого соединения.
2.3 Выделение ДНК из клеток грибов
Мы предлагаем две методики для дрожжей. Первая из них предназначена для Saccharomycescerevisiae, а вторая – для делящихся клеток Schlzosaccharomycespombe. В обоих случаях для удаления клеточной стенки и приготовления сферопластов используется зимолиаза 100 Т. Получить сферо-пласты из 5. pombeболее трудно. В этом случае мы рекомендуем контролировать процесс лизирования под микроскопом.