Курсовая работа: Анализ биологических тканей и жидкостей
Анализ лекарственных веществ в ходе их производства, хранения, распространения – это, строго говоря, не собственно медицинский, а либо способ контроля технологических процессов, либо сертификационный анализ. Но все-таки лекарства – средства лечения, поэтому уместно будет рассмотреть его в этой работе.
История анализа лекарственных средств, сначала природного происхождения, а затем и синтетических начинается много веков назад. В аптеках работали К. Шееле, К.М. Клапрот, Т.Е. Ловиц, Ю. Либих, Ф. Мор и многие другие крупные химики. Любой провизор наряду с изготовлением лекарственных препаратов занимался проведением анализов: исследовал состав сырья, проверял качества готовых лекарств и т.д.). Для этой цели в аптеках использовали всевозможные химические, а затем и инструментальные методы.
Наиболее распространенным методом в анализе лекарств сегодня стала высокоэффективная жидкостная (отчасти – тонкослойная) хроматография.
Многие лекарственные вещества (а также пищевые добавки) используют в форме рацематов, между тем разные их составляющие (энантиомеры) могут проявлять различные полезные или вредные свойства. Уже давно стоит задача использовать, по возможности, наиболее действенную форму, что стимулировало разработку методов стереоселективного синтеза, эффективных приемов разделения рацематов и методик определения отдельных энантиомеров.
Классическим методом обнаружения и определения оптических изомеров является поляриметрия. Удобна фарадеевская поляриметрия, когда «анализатор» в поляриметре вращается не механически, а электрическим полем.
Главным методом разделения смесей и определения энантиомеров является хроматография, особенно жидкостная. Разделение в этом случае основано на использовании энантиоспецифичнфх неподвижных фаз.
В СССР сложились крупные фармацевтические центры, где анализ лекарственных средств занимал значительное место. Одним из таких центров был Всесоюзный научно-исследовательский химико-фармацевтический институт им. С. Орджоникидзе (Москва). В конце XX века на базе этого института был создан специализированный центр по исследованию лекарств. Серьезные исследования в области фармацевтического анализа с применением спектрофотометрии выполнялись на Украине и на Северном Кавказе, в Пятигорской государственной фармацевтической академии.
Анализ биоматериалов с помощью ЯМР
Метод ЯМР позволяет обнаруживать и одновременно количественно определять в биологических жидкостях тысячи компонентов, в том числе метаболиты и биомаркеры, и тем самым проводить достаточно полную диагностику организма, обнаруживать на ранних стадиях различные патологии, в том числе генетически обусловленные заболевания, формировать группы риска пациентов, предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям, отслеживать реакции организма на воздействие патогенов, токсических веществ и лекарственных препаратов в динамике.
Основным преимуществом ЯМР является минимальная пробоподготовка. Кроме того, метод позволяет многократно использовать одну и ту же пробу.
Основной недостаток – по чувствительности этот метод уступает хромато-масс-спектрометрии и методам оптической спектрометрии. Но он устраняется с помощью наполнения спектра – суммирование результатов увеличивает соотношение сигнал\шум пропорционально корню квадратному из числа измерений.
Помимо ЯМР 1Н все шире используется ЯМР 13С, а также ЯМР 31Р. Но, из-за небольшой концентрации этих изотопов в организме, применение этих методов ограничено.
При количественном анализе спектра возникают определенные трудности вследствие перекрывания резонансных сигналов различных соединений. Но обычно один и тот же компонент дает сигнал в различных областях, поэтому почти всегда удается найти такую область, в которой один из сигналов достаточно хорошо отделен и пригоден для интегрирования.
Особая сложность количественного анализа биологических жидкостей и тканей, которые могут содержать сотни компонентов в очень большом интервале концентраций, в том, что обычно заранее не известно, до какой глубины необходимо проводить анализ и каким минимальным уровнем содержания компонентов следует ограничиться.
При исследовании тканей методом ЯМР их используют как в нативном, так и в экстрагированном состоянии. Но отбор биожидкостей проще осуществить, поэтому они используются чаще.
При анализе спектров любых биоматериалов возникает ряд общих проблем, решение которых требует специальных методов.
1. Подавление сигнала воды
Вода – это основа любой биожидкости. Ее сигналы всегда интенсивнее сигналов растворенных веществ. Для подавления сигнала воды можно использовать лиофилизацию, а затем растворить осадок в D2 O. Но во время лиофилизации теряются летучие и нестабильные компоненты. Вследствие этого анализ теряет точность.
Чаще для подавления сигнала воды используют специальные импульсные последовательности. Одна из них – метод селективного предварительного насыщения. – на пробу воздействуют радиочастотными импульсами большой длительности, селективно настроенными на частоту сигнала воды. Разработаны и более сложные последовательности.
2. Пробоподготовка
К точно фиксированному объему биожидкости (обычно около 500 мкл) добавляют отмеренное (около 10% по объему) количество раствора образца сравнения в D2 O известной концентрации. Чаще всего в качестве такого образца используют 3-триметил-[2,2,3,3-2 Н4 ]-пропионат натрия.
На основе интенсивностей по стандартной методике рассчитываются концентрации всех соединений.
Положение сигналов основных компонентов сильно зависит от pH образца и температуры регистрации Поэтому, чтоб такие измерения можно было сравнивать между собой, оба эти параметра должны быть строго стандартизированы. В вязи с этим перед регистрацией к образцу добавляют стандартное количество фосфатного буферного раствора.
Для большинства измерений используют частоту ЯМР 500-700 МГц.
3. Методы обработки и интерпретации спектров
Спектр ЯМР любой биологической жидкости – это суперпозиция спектров огромного числа соединений, среди которых лишь несколько десятков представляют реальный интерес, так как только их присутствие или изменение и концентрации несет информацию, важную с точки зрения медицинской диагностики.
Полный анализ занимает много времени, не целесообразен, так как не выполняет основную задачу – быстро обнаружить аномалию и определить ее природу.
Для анализа спектров используется подход, основанный на сверке информации. Сначала отбирают группу «здоровых» людей (от нескольких десятков до нескольких сотен человек) и измеряют спектры взятых у них биологических жидкостей в строго стандартных условиях. Затем каждый спектр преобразуют в гистограмму. При этом количество данных значительно сокращается без существенной потери информации. Затем интегральные интенсивности сводят из гистограммы в таблицу по спектрам для всех измеренных образцов. Полученную матрицу данных обрабатывают с помощью стандартных методов статистического анализа. При анализе биологических жидкостей пациента достаточно определить, вписывается ли значение интенсивностей в средние показатели для здоровых людей.
Идентефикация каждого компонента может оказаться достаточно важной, особенно в случае, если его можно использовать в качестве биомаркера патологии.