Курсовая работа: Аналіз процесу отримання ергостерину шляхом мікробіологічного синтезу
В 30-х роках ХХ ст. рядом дослідників було виявлено, що хлібопекарські дріжджі являються багатим джерелом ергостерину. Пізніше було встановлено, що деякі мікроорганізми можуть слугувати джерелом вітаміну D[2].
Ергостерин – ергоста-5,7,22-трієн-3β-ол – вихідний продукт виробництва жиророзчинного вітаміну D2 і кормових препаратів, збагачених вітаміном D2 . В групу вітамінів Dоб’єднують споріднені сполуки, найважливішими з яких є вітаміни D2 і D3 , що мають антирахітичну дію. Вітамін D2 (ергокальциферол) утворюється під час опромінення ультрафіолетовим випромінюванням ергостерину, вітамін D3 (холекальциферол) утворюється із 7-дегідрохолестерину. В організмі людини і тварин ці сполуки регулюють засвоєння кальцію та фосфору із їжі і відкладання їх в кістковій тканині [1].
Для прикладної медицини найбільше значення мають вітаміни D2 та D3 . Нестача вітаміну D2 погіршує абсорбцію кальцію в кишківнику, у зв’язку з чим його вміст в крові також зменшується. Це викликає підвищену активність паращитовидних залоз, завдяки чому рівень кальцію в крові утримується на невисокому рівні за рахунок мобілізації його із запасів організму. Одночасно спостерігається підвищене виділення нирками фосфору, оскільки гіперпродукція паратиреоїдного гормону знижує реабсорбція фосфору в ниркових каналах. Таким чином вітамін D2 відграє важливу роль в забезпеченні організму кальцієм, перш за все, за рахунок регуляції його засвоєння з їжі. Загальновідомо, що нестача вітаміну D2 в організмі відбувається порушення мінералізації в процесі кісткоутворення, що призводить до серйозних змін в кістковому скелеті.
В основі структури ергостерину і вітаміну Dлежать чотири вуглецевих цикла (A, B, C, D). В молекулі вітаміну Dкільце В розімкнуте. Вуглеводнева структура ергостерину та вітаміну Dвизначають їхні ліпофільні властивості [1].
1.2 Продуценти ергостерину
Джерелом ергостерину є фітопланктон, бурі і зелені водорості, але особливо багаті на ергостерин дріжджі та плісняві гриби, які слугують сировиною для його промислового виробництва. Ергостерин – основний стерин дріжджів, на який припадає 60 – 90 % від інших стеринів: вміст ергостерину складає 0,2 – 0,5 %, але в деяких випадках досягає 10 % від сухої біомаси.
Культурні раси дріжджів завжди містять більше стеринів, ніж дикі. Найбільшу кількість стеринів містять пекарські та пивні дріжджі. У відношенні ергостеролсинтезуючої здатності (% ергостеролу в абсолютно сухих дріжджах) дріжджі під час поверхневого культивування розташовуються в наступному порядку: Saccharomyces carlsbergensis (0,49 – 4,3), S . ellipsoideus (1,2 – 1,5), Rhodotorula glutinis (0,7 – 0,9), Candida utilis (0,4 – 0,6), C . tropicalis (0,2 – 0,3). В міцелії грибів Aspergillus і Penicillium вміст стеринів може досягати 1,2 – 1,4 % (P . westlingii близько 2,2 %) в розрахунку на сухий міцелій.
Бактерії, як правило, синтезують дуже малі кількості стеринів. Зазвичай, вміст стеринів в їхніх клітинах складає 0,001 – 0,1 мг/г сухої біомаси. Стерини виявлено в Lactobacillus arabinosus , L. pentosus , Escherichia coli , Azotobacter chroococcum , Micromonospora sp. , Streptomyces griseus , Sphaerotillis natans , Rhodospirillum rubrum . Але відомо два представника бактерій: Halobacterium cutirubrum і Methylococcus capsulatus , що синтезують високі кількості сквалену (1,0 і 5,5 мг відповідно на грам сухих клітин). Сквален і його чотири гідроформи виділені із метанутворюючої бактерії Methanobacillus kuzneceovii [1].
1.3 Біосинтез ергостерину
Стерини, каротиноїди, сполуки груп Q-коферментів належать до терпенів і мають спільний шлях біосинтезу за «ізопреновим правилом». У відповідності до цього правила, каротиноїди (політерпени), стерини (тритерпени), а також убіхінони і гіберелінова кислота синтезуються із ізопренових одиниць в результаті проходження чотирьох стадій: 1) утворення мевалонату із ацетил-КоА або лейцину; 2) дегідратація і декарбоксилювання мевалонілпірофосфату з утворенням «активного ізопрену» - ізопентенілпірофосфату і конденсація ізопренових ланок з утворенням ациклічних терпенів різної довжини; 3) циклювання ациклічних структур; 4) подальша модифікація циклічної структури.
Інтермедіатами синтезу стеринів є ацетат, мевалонова кислота, сквален, ланостерин. Сквален – загальний попередник стеринів рослинного і тваринного походження, накопичується в дріжджах і під час аерування перетворюється в стерин.
Стартовою сполукою в біосинтезі стеринів є ацетат. Дві молекули ацетил-КоА конденсуються із утворенням ацетоацетил-КоА, який в свою чергу конденсується з ще одною молекулою ацетил-КоА, утворюючи β-гідрокси-β-метилглутарил-КоА. Під час відновлення даної сполуки утворюється мевалонова кислота (МВК), котра за наявності АТФ фосфорилюється із утворенням пірофосфату МВК. За наявності АТФ шляхом декарбоксилювання і дегідрування пірофосфат МВК перетворюється в 5-вуглеводневу ізопренову одиницю – ізопентенілпірофосфат. Ізопентенілпірофосфат (ІПФ) ізомерується до стадії деметилалілпірофосфату (ДМАПФ). Потім відбувається конденсація ІПФ і ДМАПФ з утворенням геранілпірофосфату. Ці сполуки, що містять 10 атомів вуглецю, конденсуються з ІПФ з утворенням фарнезілпірофосфату
Фарнезілпірофосфат далі димеризується із утворенням сквалену С15 + С15 = С30 :
Під час циклювання і відщіплення протону утворюється ланостерин, попередник холестерину і ергостерину:
Перетворення ланостерину в ергостерин відбувається в результаті наступних стадій:
1) деметилювання ланостерину;
2) трансалкілування з утворенням 24(28)-метиленової групи і одночасним відновленням С-24(25) подвійного зв’язку;
3) десатурація бічного ланцюга з утворенням С-22(23) подвійного зв’язку;
4) ізомеризація ∆8 ∆7 ;
5) дегідрування з утворенням ∆5 ;
6) відновлення 24(28) метиленової групи до метильної [1].
1.4 Умови утворення ергостерину дріжджами
Найбільш високу кількість стеринів синтезують штами Saccharomyces carlsbergensis . Їх біомаса може містити більш ніж 10 % ергостерину.
Важливою умовою синтезу ергостерину дріжджами є достатнє аерування. В анаеробних умовах в клітинах дріжджів накопичується попередник ергостерину – сквален. Доведено, що кисень індукує синтез стеринів, надаючи активуючу дію на епоксидазу сквалену – перший фермент біосинтетичного шляху. Індукція синтезу ергостерину починається за 0,03 %-го вмісту кисню в газовій фазі і досягає максимуму за 2 %-ї концентрації.
Для біосинтезу стеринів є важливим, щоб середовище містило великий надлишок вуглеводів і мало азоту. Дріжджі багаті на білок, як правило, містять мало стеринів. Ці дані, головним чином, стосуються пекарських дріжджів. У випадку дріжджів роду Candida високе співвідношення C/N в середовищі призводить до накопичення ліпідів, а не ергостерину.