Курсовая работа: Ферритин как маркер железодефицитной анемии и опухолевый маркер

Ближайшие к нам субъединицы изображены толстыми лентами, внутри глобулы в центре видно железосодержащее ядро.

Бислой альфа-спиралей перпендикулярен радиус-вектору белковой молекулы. Каждая субъединица контактирует в апоферритине с пятью соседними. Длинная петля, почти лишенная вторичной структуры, расположена на внешней поверхности молекулы. Кроме того, молекулы ферритина могут образовывать суперолигомеры - димеры и тетрамеры [18].

Субъединицы плотно упакованы, за исключением того, что в местах контакта трех субъединиц есть узкие каналы диаметром около 1 нм, пронизывающие глобулу. У ферритинов высших организмов вокруг этих осей третичной симметрии локализуются преимущественно гидрофильные остатки. В субъединицах ферритина позвоночных и растений боковые цепи, формирующие наиболее узкие части каналов на краю, открывающемся в полость молекулы, высоко консервативны. Это 3 симметрично расположенных аспартата и 3 глутамата. Каналы, проходящие вдоль осей третичной симметрии, являются главным входным путем для железа и сайтами окисления Fe(II) [19].

Внутренняя поверхность четвертичной складчатости, выстланная остатками 12 лейцинов высоко гидрофобна у L-ферритинов млекопитающих. В Н-цепях на стороне полости находятся 4 гистидина и обычно 4 лейцина на наружной поверхности.

Все молекулы ферритинов имеют полость для хранения железа. Несмотря на то, что внутренняя поверхность участвует в формировании железосодержащего ядра, ее аминокислотные остатки не высоко консервативны среди млекопитающих. Полагают, что главным фактором, определяющим формирование ядра, является распределение зарядов на внутренней поверхности.

Ферритины, изолированные из тканей млекопитающих, состоят из смеси изоферритинов с широким спектром состава субъединиц и содержания железа [20, 21]. Возможны 25 изоферритинов с соотношением субъединиц: Н₂₄ L₀ , H₂₃ L₁ , H₂₂ L₂ … H₀ L₂₄ , но в основном спектр распределения субъединиц в изоферритинах заключен в пределах H₂₂ L₂ - Н₂ L₂₂ . Обычно ферритины с преобладанием L-субъединиц характерны для органов, запасающих железо (печень и селезенка), и эти ферритины обычно имеют относительно высокий средний уровень содержания железа (более 1500 атомов Fe на молекулу). Богатые Н-субъединицами ферритины, характерные для сердца и мозга, имеют низкое содержание железа (менее 1000 атомов Fe на молекулу).

Вследствие различий по составу субъединиц молекулярная масса изоферритинов колеблется от 440 кДа у легких фракций изоферритинов селезенки до 500 кДа у тяжелых мышечных ферритинов. Общая молекулярная масса ферритина может удваиваться за счет включения кластера железа и достигать 900 кДа [22]. Однако ферритины обычно не полностью насыщены железом и обладают молекулярной массой, промежуточной между апоферритином и полностью заполненным холоферритином.

L-цепи являются более щелочными по сравнению с Н-цепями. Вследствие этого богатые Н-субъединицами ферритины эритроцитов, лимфоцитов, моноцитов, мышц, тимуса, мозга и других тканей обладают изоэлектрической точкой в диапазоне 4,5-5,0, а ферритины печени и селезенки с преобладанием L-субъединиц имеют pI 5,3-5,8 [23].

Субъединицы ферритинов содержат небольшое число углеводородов. Состав и количество сахаров сильно варьируют в зависимости от видовой и тканевой принадлежности, но у человека суммарно они составляют 2,4% массы апоферритинов печени и селезенки и около 5% у сердечных изоформ [24].

В отличие от высоко консервативной белковой глобулы, структура железосодержащих ядер довольно вариабельна, в том числе вследствие различий в составе, особенно в содержании неорганического фосфата [25]. Большая минеральная структура не имеет какой-либо преимущественной ориентации по отношению к белковой оболочке, хотя аминокислотные остатки на ее внутренней поверхности считаются важными для нуклеации. Нативные ядра человеческом ферритине - ферригидриты (5Fe₂ O₃ · 9H₂ O) с различной степенью кристалличности. Каждый атом Fe(III) окружен приблизительно шестью атомами кислорода на расстоянии 1,93 ангстрем. Нативные ферритины содержат неорганический фосфор, его содержание колеблется в пределах 10-40 атомов Fe на 1 атом Р в зависимости от уровня запаса железа [26].

Проникновение атомов железа в полость белковой глобулы и формирование железосодержащего кластера требует предварительного окисления двухвалентного железа до трехвалентного [27].

Работы, выполненные на рекомбинантных ферритинах, содержащих субъединицы одного типа, свидетельствуют о том, что ферроксидазная активность связана с Н-цепями. L-цепи в ферритинах позвоночных лишены внутрисубъединичных ферроксидазных центров [28]. Несмотря на это, ферритин селезенки с высоким процентом L-цепей (85%) имеет высокое содержание железа (в среднем 2700 атомов на молекулу). Рекомбинантные L-гомополимеры человека при экспрессии в E. coli связывают менее 10 атомов Fe на молекулу, в то время как Н-гомополимеры при тех же условиях аккумулируют до 200-300 атомов.

Эти экспериментальные наблюдения привели к заключению, что L-цепи лучше для нуклеации ферригидрита. Возможным объяснением этому может быть то, что их поверхности, обращенные в полость, имеют больше карбоксильных лигандов, чем Н-цепи. Слабая феррроксидазная активность L-цепей может быть объяснена наличием альтернативного сайта окисления Fe(II), образованного His136 и Asp139 в качестве лигандов металла [29]. Напротив, Н-ферритины - относительно слабые ядрообразователи. Электронная микроскопия свидетельствует, что ядра рекомбинантных L-ферритинов и нативных гетерополимеров крупнее и регулярнее, чем у Н-ферритинов [30]. Н-цепи необходимы для быстрого окисления поступающего железа.

Функции двух типов цепей взаимно дополняют друг друга. Кинетика накопления и высвобождения железа оптимальна при определенном количественном соотношении между двумя субъединицами. В экспериментах с Н/L гетерополимерами, реорганизованными в разных пропорциях, показано, что железо инкорпорировалось оптимально в молекулах, содержащих от 5 до 8 Н-цепей, что соответствует составу изоферритинов селезенки и печени [31].

Возможным объяснением того, что изоформы, наиболее интенсивно инкорпорирующие железо, практически никогда не насыщены железом полностью, также является стремление сохранить условия, при которых скорость процессов обмена железа максимальна. Экспериментально установлено, что первоначальные этапы нуклеации (формирования центров роста кристаллов) и роста ядер протекают относительно медленно. С увеличением размеров кластера увеличивается и скорость присоединения или отрыва атомов железа; максимальная скорость обычно характерна для ядер, содержащих 2000-2500 атомов железа. При дальнейшем росте кристалла скорость обмена железом снижается. Такая закономерность связана с тем, что на самой поверхности ядра, достигшего необходимых размеров, образуются дополнительные центры окисления железа [32]. Данный механизм также увеличивает способность ферритина экстренно поглощать или высвобождать железо.

Ферритин выполняет в организме двойственную функцию. Он запасает в клетках растворимое железо, которое при необходимости может быть легко задействовано для синтеза различных веществ. В то же время ферритин защищает организм от токсического действия ионов металлов. Помимо железа ферритин способен связывать и другие ионы, некоторые из которых токсичны (алюминий, бериллий).

Механизмы и кинетика обмена железа в организме изучаются очень интенсивно. Детально установить механизм процессов обмена железа in vivo очень сложно. Большинство исследований выполнено in vitro, и предложенные модели не могут быть полностью отождествлены с реальными процессами в организме.

Известно, что связывание железа трансферрином и ферритином требует предварительного изменения степени окисления металла от +2 до +3, а его высвобождение из этих молекул сопровождается обратным процессом восстановления. Важнейшую роль в этих процессах играют также низкомолекулярные хелатирующие соединения. Они являются необходимым промежуточным звеном в переносе железа от транспортных и депонирующих белков к местам утилизации железа.

In vitro железо может быть удалено и из ферритина, и из продукта его деградации гемосидерина (см. п. 4). Возможно высвобождение под действием небольших молекул-восстановителей, таких как 2,2-бипиридин, сульфонат батофенантролина, феррозин, дитионит и тиогликолят [33]. Высвобождение железа стимулируют также многие физиологические восстановители: восстановленные флавины, супероксид, дигидролипоат и родственные сульфгидрилы, цитрат, аскорбат и АТФ.

Интенсивность обмена железа в ферритине может регулироваться за счет его структурных особенностей. В кристаллическом состоянии поры, ведущие в полость апоферритина, открыты всего лишь на несколько ангстрем, но динамические структурные флуктуации могут позволить некоторым низкомолекулярным восстановителям достаточно быстро проникнуть внутрь белковой глобулы, непосредственно провзаимодействовать с поверхностными атомами железосодержащего ядра, восстановить и удалить их. Хелатор Fe(II) (которым может быть и сам редуктант) помогает железу найти путь из глобулы. Низкомолекулярные хелаторы трехвалентного железа, которые мобилизуют Fe(III) из ферритина в течение часов и дней (гидроксипиридиноны), также могут входить в молекулу и покидать ее, неся железо в виде Fe(III)-хелатных комплексов. Такая модель подтверждается исследованиями Takagi e. a. [34], показавшими, что локальная перестройка в сайтах кооперативных взаимодействий субъединиц (области тройничной складчатости) может увеличивать скорость выхода железа из ферритина. При замещении консервативного лейцина в позиции 134 пролином белок формировался, окислял Fe(II) и минерализовал Fe(III), а время полного растворения минерала (480 атомов железа) in vitro снижалось до 5 мин по сравнению со 159 мин для родительского белка.

Подтвержден также тот факт, что большие железосодержащие ядра ферритинов, подвергшихся деградации в лизосомах (см. п. 4.), не могут встраиваться в апоферритин в неизменном виде: белковые субъединицы не могут формировать оболочку вокруг минеральных ядер. Необходимо предварительное растворение ядра и синтез его в полости апоферритина de novo. Сходным образом происходит и обмен железа между двумя молекулами ферритина, например, между плазматическим ферритином, несущим железо от клеток ретикулоэндотелиальной системы, и ферритином печени.

4. Катаболизм ферритина

Как любому биологически активному веществу, участвующему в протекании окислительно-восстановительных процессов, ферритину для сохранения функциональной активности необходимо регулярное обновление белковой части. Ферритин из цитоплазмы поступает в лизосомы, где происходит протеолиз белковой оболочки и частичная деградация железосодержащего ядра. Образовавшиеся структуры носят название сидеросомального ферритина. Затем железо освобождается от связавших его хелаторов и постепенно заключается в новую, интактную молекулу апоферритина. Данное предположение подтверждается наличием в сидеросомах электрофоретически подвижных субъединиц, подвергшихся радикальному отщеплению N-концевых аминокислотных остатков и вследствие этого меньших по массе, являющихся аналогами цитоплазматических Н- и L-цепей [35].

В условиях избытка железа способность клеток синтезировать необходимое количество ферритина истощается. При этом частично железо так и остается в слабо структурированной форме хранения - сидеросомальном ферритине, а также подвергается дальнейшей деградации до нерастворимого гемосидерина. Название отражает источник содержащегося в нем железа - гемоглобин, но в гемосидерине железо находится не в форме гема. Гемосидерин представляет собой агрегат гидроокиси железа, соединенного с белками, гликозаминогликанами и липидами. При электронной микроскопии гемосидерин виден как нерегулярные массивные кластеры электронно-плотных частиц, большинство из которых окаймлены мембранами.

Гранулы гемосидерина распознаются антителами к ферритину, но их иммунореактивность значительно ниже, чем у цитозольного ферритина [36]. Эти данные подтверждают гипотезу, что гемосидерин - продукт деградации ферритина.

5. Регуляция биосинтеза ферритина

Механизмы регуляции биосинтеза ферритина интенсивно исследуются. Главным фактором, влияющим на метаболизм ферритина, является количество железа в организме. У животных и человека основным является посттранскрипционный механизм контроля. Механизм контроля трансляции был предложен после наблюдения, что в ответ на присутствие железа происходит увеличение количества ассоциированной с полисомами мРНК, при этом суммарное количество мРНК не возрастало, а уменьшалась фракция неактивной мРНК [37].

Секвенирование мРНК Н- и L-цепей ферритина показало наличие необычно длинных 5'-нетранслируемых областей (UTRs), размером соответственно 210 и 168 нуклеотидов [38]. С помощью компьютерного анализа было предсказано существование в пределах первых 75 нуклеотидов специфической стержне-петлевой структуры. Такая последовательность - железо-ответственный элемент (IRE, iron responsive element) - необходима для регуляции железом трансляции мРНК.

Первоначально предполагалось, что цитоплазматическая мРНК могла инактивироваться присоединением субъединицы ферритина, действующей как репрессор, а железо вызывало дерепрессию, инициируя сборку в 24-меры ферритина, способные затем инкорпорировать железо. Последующие работы подтвердили данное предположение, но репрессорным белком оказалась не субъединица ферритина, а цитозольный белок с молекулярной массой порядка 90 кДа, который специфически связывается с IRE с высокой аффинностью (K_d =10^-10 -10^-11 M). Этотбелокизвестенкак IRE-binding protein (IRE-BP), iron regulatory factor (IRF), ferritin repressor protein (FRP), P-90 или iron regulatory protein (IRP). Было установлено, что IRP является белком цикла Кребса - аконитазой [39]. Аконитаза содержит железосерный кластер [4Fe-4S], связывание железа в котором обратимо. В несвязанной форме [3Fe-4S] один из атомов железа в кластере замещается шпилькой мРНК, при этом аконитаза действует как репрессор трансляции. При повышении уровня железа в цитоплазме железосерный кластер принимает форму [4Fe-4S], шпилька мРНК вытесняется из кластера, аконитаза диссоциирует от мессенджера и начинается синтез субъединиц ферритина.

Важным фактом является то, что шпильки мРНК (IRE) свойственны не только для мРНК ферритина [40]. Аналогичные структуры, способные связываться с теми же IRP, обнаружены в 3'-нетранслируемой области мРНК клеточного рецептора трансферрина (TfR), 5'-UTR эритроид-специфической синтетазы дельта-аминолевулиновой кислоты (eALAS).

Железо регулирует экспрессию TfR в направлении, противоположном экспрессии ферритина: высокий уровень железа ведет к низкой экспрессии TfR, и наоборот. Связывание c IRP предохраняет мРНК TfR от деградации. Таким образом, когда существует необходимость в железе, синтезируется больше TfRs, что позволяет клеткам захватывать больше железа, и когда клетки насыщены железом, синтезируется больше ферритина для защиты от токсического действия.