Курсовая работа: Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей
Различают два вида люминесценции, отличающихся по времени жизни и энергии излучаемых фотонов. Исходя из наиболее характерного качественного признака люминесценции – степени её длительности – различают флуоресценцию – свечение мгновенное, появляющееся лишь в момент возбуждения светящегося объекта, и фосфоресценцию – свечение более длительное, продолжающееся иногда весьма долго по окончании возбуждения. Изучение люминесценции позволяет судить о строении поглощающих свет молекул и участков молекул (хромофоров), а также производить их качественный и количественный анализ, выяснять физико-химические свойства среды, окружающей молекулы или их хромофорные группы. [6]
Различают собственную (первичную) люминесценцию, наблюдаемую без окрашивания, и вторичную (наведённую), которая возникает после обработки химическим агентом или красителем. [9]
Согласно закону Стокса, спектр флуоресценции лежит в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения того же соединения. Это означает, что средняя энергия квантов флуоресценции меньше средней энергии поглощённых квантов.
Правило Каши относится к форме спектра флуоресценции при возбуждении объекта светом разных длин волн. Испускание квантов флуоресценции всегда происходит с нижнего возбуждённого уровня молекул, независимо от того, на каком уровне оказался электрон в результате поглощения. Т.е. какой бы длиной волны не была возбуждена молекула, излучение будет происходить из одного и того же состояния молекулы. [7]
Интенсивность флуоресценции (Iф) зависит от концентрации флуоресцирующих молекул (Z), интенсивности возбуждающего света (Iв), значение молярного коэффициента поглощения (Еλ) и величины квантового выхода флуоресценции
(Кλ): Iф=2,3*Iв* Еλ* Кλ* Z*L,
где L – длина оптического пути в объекте. Измеряемая интенсивность флуоресценции даёт информацию о величине Кλ*Z, т.е. о количестве флуоресцирующих молекул и их способности флуоресцировать (квантовый выход). Это уравнение справедливо при поглощении объектом менее 5% возбуждающего света, что обычно имеет место в физиологических опытах. При поглощении более 5% света наблюдается нелинейная зависимость. [8]
Для характеристики флуоресценции помимо её интенсивности и квантового выхода, можно использовать значения смещения максимума флуоресценции по спектру, время жизни флуоресценции молекулы и степень поляризации флуоресценции. Перечисленные параметры позволяют получить информацию о характере взаимодействия флуоресцентных молекул между собой и с окружающей их средой. [6]
1.2 Развитие флуоресцентной микроскопии
Люминесцентная микроскопия – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.
Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико–химического состояния микроскопируемого объекта, что и обуславливает возможность использование люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток. Первичная люминесценция присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1, некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная, или наведённая, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами, что позволяет проводить люминесцентно–цитологический и люминесцентно–цитохимический анализ. [16]
В истории развития люминесцентной микроскопии выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики.
Люминесцентная микроскопия появилась в начале прошлого века как разновидность ультрафиолетовой микроскопии. В 1910 году А. Кёллер доказал принципиальную возможность создания люминесцентного микроскопа. В 1911 г. изобретён люминесцентный микроскоп, который был использован русским ботаником М.С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток. Прогресс люминесцентной микроскопии в дальнейшем был связан с введением в практику флуоресцентных красителей, так называемых флуорохромов, которые были разработаны Хайтингером и его сотрудниками в 1935 году. Применение сильно разбавленных растворов флуорохромов, избирательно связывающихся с определёнными структурами клеток, и прежде всего акридинового оранжевого, было введено Штруггером в 1940 году. Происходило и усовершенствование аппаратуры (разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки), разработка новых люминесцентно-цитохимических методов, изысканием новых областей её применения, нашедших широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико–биологических исследований.
В настоящее время различают несколько типов люминесцентной микроскопии в зависимости от характера освещения.
При освещении объекта проходящим светом (обычный путь освещения) имеют дело со светопольной люминесцентной микроскопией.
Замена светопольного конденсора конденсором тёмного поля даёт возможность осуществить люминесцентную микроскопию в тёмном поле (люминесцентная ультрамикроскопия).
В случае освещения объекта сверху - имеют дело с люминесцентной микроскопией в падающем (отражённом) свете. [11]
1.3 Флуорохромы и флуорохромирование
У подавляющего большинства биологических объектов их собственная неяркая люминесценция не позволяет проводить люминесцентно-микроскопические исследования и для избирательного выявления определённых структур применяют люминесцентные красители - флуорохромы. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами.
Известно несколько десятков органических соединений, с успехом используемых в качестве флуорохромов. К ним относятся красители: тиазоловые, хинолиновые, азокрасители и особенно акриловые производные. Хорошими флуорохромами являются некоторые естественные пигменты (хлорофилл, липохромы), алкалоиды (берберин, хинин), углеводороды (бензпирен, дибензаантрацен). Флуорохромы применяются в сильно разведённых водных или спиртовых растворах (от 1:1000 до 1:100000). Углеводороды (бензипрен) растворяют в насыщенном водном растворе кофеина.
Флуорохромирование проводят либо прижизненно, либо на фиксированных препаратах. Прижизненное флуорохромирование в свою очередь может быть осуществлено или на целом животном или растительном организме (путём инъекции или введения с пищей), или на отдельных тканях и клетках. Прижизненное флуорохромирование особенно полезно при исследованиях функционального состояния и физико-химической характеристики органов, тканей, клеток. [3]
Преимущества флуоресцирующих красителей перед обычными цитологическими или гистологическими реактивами заключается прежде всего в возможности применять флуорохромы в самых минимальных количествах и в очень слабых концентрациях (1:100000 – 1:5000000). Благодаря этому химическое, повреждающее воздействие на клетки сводится до минимума, объект изучается в наиболее физиологических условиях. Относительная безвредность флуорохромирования позволяет так же широко использовать метод прижизненной окраски, имеющий большие преимущества, особенно в цито- и гистофизиологии.
Второе крупное достоинство метода флуорохромирования состоит в быстроте работы. Для проведения исследования обычно требуются доли минуты. Даже самая длительная окраска препаратов занимает максимум 20-30 минут. Расход флуоресцирующих красок из-за больших разведений очень невелик.
Выбор флуорохрома диктуется целью исследования, характером объекта, природой флуоресцирующего вещества, его кислотностью, цветом и др.
По физико-химическим свойствам флуоресцентные красители можно разделить на три группы.
1. Щёлочные флуорохромы – характеризуются тем, что находятся в кислой среде в сильно диссоциированном состоянии. Флуоресцирующим компонентом краски является положительно заряженный катион. В сильно щёлочных растворах такие краски находятся в недиссоциированном состоянии.
2. Кислые флуорохромы – диссоциируются в щёлочной среде. Флуоресцирующим компонентом краски является отрицательно заряженный анион.
Электронейтральные флуорохромы – слабо кислые или слабо щёлочные краски, диссоциация которых при флуорохромировании не имеет практического значения, поскольку флуоресцирующими свойствами обладает целая молекула. [5]
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объекты люминесцентной микроскопии
Собственная (первичная) люминесценция присуща только некоторым структурам в исследуемых микроскопических препаратах. Большинство веществ биологического происхождения имеет весьма мало интенсивную голубую, синюю или фиолетовую люминесценцию (максимумы в спектрах люминесценции многих из них лежат в ультрафиолетовой области спектра), поэтому возбуждать люминесценцию биологических объектов необходимо ультрафиолетовым светом, а в качестве «запирающего» светофильтра выбирать такой, который отсекает только ультрафиолет.
Природными люминесцирующими веществами растительной клетки являются хлорофилл, порфирин, фикоэритрин, а также клетчатка, пектин, хитин. Представители разных систематических отделов растений обладают различным набором хлорофиллов и фикобилинов. Диффузное распределение пигментов, специфичное для клеток водорослей, вызывает свечение самих клеток. У высших растений наблюдается свечение пластид. Пигментный состав, а значит и спектральные характеристики, в том числе люминесцентные, одноклеточных водорослей более вариабельны, чем у многоклеточных водорослей и высших растений, и в большей степени зависят от условий обитания, возраста, сезона года и т.д. [1]
Некоторые витамины (А, В2 ), пигменты (липофусцины, хлорофилл), а так же другие вещества под влиянием более или менее длительного освещения ультрафиолетовым излучением претерпевают фотохимические изменения и перестают люминесцировать. Поэтому микроскопирование таких веществ следует проводить по возможности быстро, часто меняя места наблюдения в исследуемом объекте. [2]