Курсовая работа: Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей
Витамин В2 обладает собственной зелёной флуоресценцией (в некоторых животных клетках обнаружена так же жёлто-зелёная флуоресценция). Оптимум люминесценции данного вещества находится при рН от 3 до 9, что необходимо учитывать при проведении исследований. Типичная флуоресценция рибофлавина зависит от присутствия свободной 3-аминогруппы. Эта флуоресценция (максимум на 565 нм при рН 60) служит для количественного определения витамина В2 . Интенсивность флуоресценции сравнивается с каким-либо стандартом (чаще всего чистый рибофлавин), она прямо пропорциональна содержанию витамина.
Витамин В1 не флуоресцирует ни в чистом виде, ни в водном растворе. Способность к сине-зелёной флуоресценции проявляет тиамин только в комплексе с носителем. При окислении витамин В1 превращается в тиохром – жёлтое вещество с интенсивно синей флуоресценцией. В щёлочном растворе тиохром очень чувствителен к свету и флуоресценция его исчезает необратимо. Свойством витамина В1 окисляться в тиохром пользуются в тесте на этот витамин: водный раствор тиамина окисляется посредством железосинеродистого калия в тиохром, флуоресценция которого определяется фотоэлектрически после экстракции тиохрома изобутиловым спиртом. Интенсивность флуоресценции зависит от щёлочности раствора и количества находящегося там тиохрома. Результаты, получаемые этим методом, находятся в полном соответствии с биологическими тестами.
Никотиновая кислота и её амид так же связаны с коллоидальным носителем. Амид никотиновой кислоты присутствует в двух коферментах: кодегидраза-1 и кодегидраза-2. Кодегидраза-2 встречается практически во всех живых клетках. Свойства его очень близки к свойствам кодегидразы-1: оба вещества бесцветны, растворимы в воде, нерастворимы в органических растворителях. Эти носители дают хорошую флуоресценцию при освещении в УФ-свете, что используется для их определения.
Витамин С в водном растворе не флуоресцирует. Только при большой концентрации аскорбиновой кислоты с коллоидным носителем появляются зелёные, довольно лабильные по отношению к ультрафиолетовым лучам капли.
Витамин К даёт типичную адсорбцию с максимумом при 234, 248, 261, 270 и 320 нм (в ультрафиолетовой области). Витамин К обладает белой флуоресценцией в свете аргоновой лампы. Н.А. Андреев и В.Н. Букин (1949) разработали количественный флуоресцентный метод определения фолиевой кислоты в клетках. Ими построена кривая распределения интенсивности в спектре флуоресценции кислоты, показано изменение интенсивности в спектре флуоресценции кислоты, показано изменение интенсивности свечения в зависимости от рН раствора. Описан метод экстрагирования кислоты, её адсорбции на активированном угле (обработанном анилином) с последующим элуированием спиртом: полученный раствор упаривают и окисляют перманганатом. Измерение интенсивности флуоресценции авторы проводят при рН 4,0-4,5, пользуясь светофильтром (470 нм), применяя в качестве стандарта раствор фолиевой кислоты концентрации 2 мл в 100 мл воды. Для полного извлечения фолиевой кислоты необходимо подвергать дополнительной ферментативной обработке продукты, которые содержат много белковых веществ. [1,3]
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Огромную роль в исследованиях физиологии растительных организмов на современном этапе играют флуоресцентные методы. Их неотъемлемой частью является люминесцентная микроскопия, получившая широкое применение в изучении различных параметров жизнедеятельности высших и низших растений. Этот метод обладает рядом преимуществ, заключающихся в быстроте, разносторонности и высокой точности исследований.
В частности, метод люминесцентной микроскопии позволяет быстрое выявление физиологического состояния клеток микроводорослей, что важно для изучения «цветения» водоёмов, определения качества водной среды.
Постоянно возрастающая антропогенная нагрузка на биоценозы требует быстрых и точных методик биотестирования вод. Для решения этой проблемы методом люминесцентной микроскопии проводится оценка степени токсичности отдельных веществ для водорослей.
Количественная регистрация интенсивности флуоресценции, которая может быть определена с помощью рассматриваемого метода исследования, является отправной точкой в изучении фотосинтетического аппарата микроводорослей, который, как известно, в первую очередь реагирует на малейшие изменения условий среды.
Особенностью люминесцентной микроскопии является возможность качественного и количественного определения нефлуоресцирующих веществ: витаминов, специфических белков, ферментов.
Люминесцентная микроскопия, в середине прошлого века нашедшая применение в изучении физиологии микроводорослей, занимает особое место в современной системе методов научн?