Курсовая работа: Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы
А Т Г Ц А А Т Т – Ц А Г Т Ц
Т А Ц Г – Т Т А А – Г Т Ц А Г
Рис. 1. Сшивание генов
При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем (коннекторный метод получения гибридных молекул ДНК), используя концевую (терминальную) дезоксинуклеотидилтрансферазу из тимуса теленка или поли(А) – полимеразу E.coli.
Также, для стыковки фрагментов применяют так называемые линкеры (рис. 2) (или «переходники») – короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:
– А Т Г Ц А А Т Т Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А Т А Ц Г
Т А Ц Г Т Т А А Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т А Т Г Ц
Фрагмент 1 Линкер Фрагмент 2
Рис. 2. Объединение фрагментов линкерами
Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем, часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.
После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, её разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в её геном и реплицирваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами . К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями:
1. Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции.
2. Иметь свойства репликона.
3. Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.
Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д. Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды. Плазмидами называют стабильно наследуемые бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности). Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Количество плазмид в клетке может колебаться от одной до более ста.
Первый плазмидный вектор был получен С. Коэном (1973). Его источником была плазмида E . coli R6-5 c Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур.
Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз (рис. 3).
Рис. 3. Схема использования плазмиды pBR322 для отбора клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды[14].
Возможности плазмид для генетической инженерии не беспредельны, что связано с их небольшими размерами. Когда нужно клонировать крупные фрагменты ДНК, удобнее использовать векторы на основе бактериофага λ. Геном фага λ досконально изучен[9]. В центральной части линейного генома фага содержится область, необязательная для литической инфекции, которую и используют для вставки клонируемой ДНК. ДНК фага λ разрезают с помощью рестриктазы Eco RI, удаляют необязательную центральную область и на её место встраивают нужный фрагмент ДНК, получая, таким образом, конкамер – предшественник для упаковки фаговой ДНК в зрелые фаговые частицы. Фаг λ очень пластичен: без нарушения развития фага из него можно убрать до 25% ДНК или пристроить до 6% лишней ДНК. В этот фаговый вектор можно встраивать до 23 000 н.п.
В тех случаях, когда не хватает возможностей фага, используют ещё более крупные векторы – космиды . В состав космид входят: ген (маркер) резистентности к антибиотикам, репликон плазмиды и фрагмент ДНК фага λ (так называемый cos-участок). Этот фрагмент представляет собой однонитевые комплементарные участки на концах фаговой ДНК, т.е. «липкие концы».
Ещё один вид векторов – фазмиды , искусственные гибриды между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК они в одних условиях могут размножаться как фаги, а в других – как плазмиды.
Векторы на основе нитевидных фагов применяют тогда, когда удобнее работать с одной цепью ДНК. Так, фага М13 и fd содержат кольцевую одноцепопочечную ДНК с полностью изученными последовательностями нуклеотидов.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae представляют собой перспективные модели для экспериментов с рекомбинантными ДНК. Их гаплоидный геном содержит 1,4 х 107 н.п. (в 3 раза больше, чем у E . coli ), распределенных по 17 хромосомам. Дрожжи не инфицируются вирусами, но в их клетках выявлена плазмида, используемая в качестве вектора – 2 мкм-плазмидная ДНК. Важной особенностью дрожжевых систем является то обстоятельство, что клонируемые фрагменты ДНК способны к рекомбинации с гомологичными участками дрожжевого генома, что ведет к стабильной сайт-специфической трансформации последнего (независимо от сохранения или утраты вектора).
Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (или химерными ) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями(CaCl2 ), обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком.
Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.
Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение её от общей массы возможно также в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5–10 бактерий на 1 см2 поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном , причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.
Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту (иммунологический метод Брума–Джилберта) [4]. Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации (Грюнштейн – Хогнесс) [18]. (рис. 4).
