Курсовая работа: Кинетика клеток
Подвижность ресничек и жгутиков обусловлена свойствами именно аксонемы, но не других компонентов этих органелл (т. е. клеточной мембраны, цитоплазмы и др.).
4.1.2 Самосборка микротрубочек и ее регуляция
В любой живой клетке происходит агрегация тубулина с образованием микротрубочек и распад этих структур. Вопрос о том, как регулируются процессы сборки и деструкции микротрубочек имеет первостепенное значение для понимания многих проявлений жизнедеятельности клетки.
Изучение invitro полимеризации тубулина, выделенного из нервных клеток, оказалось ценным источником информации для понимания механизма сборки микротрубочек invivo и путей управления этим процессом. Если нейротубулин находится в растворе в виде димеров в присутствии связанных с ним белков, то в определенных условиях легко идет процесс самосборки. Полимеризация происходит в условиях умеренной ионной силы, при слабо кислом рН (около 6,6—0,7), в присутствии нуклеотидов (GTP) и ионов, магния. Направление реакции зависит также, от температуры: invitro при физиологических температурах идет полимеризация тубулина с образованием микротрубочек, а снижение температуры до 0°С вызывает их быструю деполимеризацию (рис. 8).
Рисунок 8. «Реакция полимеризации димеров тубулина с образованием микротрубочек. Указано влияние двухвалентных ионов и температуры».
4.2 Микрофиламенты
Микрофиламенты эукариотических клеток представляют собой длинные нитевидные структуры толщиной 5-7 нм, находящиеся в цитоплазме. Они состоят главным образом из актина (хотя можно обнаружить и другие белки), в связи, с чем их часто называют актиновыми филаментами (или нитями). Они иногда образуют группы или пучки, а в некоторых высоко специализированных клетках, например в мышечных волокнах, упорядоченные и стабильные структуры. Чаще, однако из микрофиламентов формируются нестабильные пучки или тонкие сетчатые структуры, их форма и локализация в клетке изменяются в зависимости от фазы жизненного цикла клетки, ее движения и т. п. Это означает, что, подобно цитоплазматическим микротрубочкам, микрофиламенты немышечных клеток представляют собой изменяемые структуры, способные к самосборке или деполимеризации на составляющие их молекулы в зависимости от нужд клетки.
Морфологию микрофиламентов и их поведение в процессе клеточного движения и цикла развития клетки много изучали на культуре животных клеток с помощью флуоресцирующих антител против актина, а также против других белков (миозин, тропомиозин и а-актинин), которые часто обнаруживаются в микрофиламентах. Когда клетки находятся в состоянии покоя и прикреплены к стенкам сосуда, в котором живут, в них можно наблюдать длинные пучки микрофиламентов, тянущиеся сквозь всю клетку, по-видимому, непосредственно под клеточной мембраной. В «возбужденные» выступы клетки с нестабильными, как бы волнующимися краями они обычно не заходят. Пучки микрофиламентов называются стрессовыми, типичны для нормальных клеток и отсутствуют в клетках, трансформированных онкогенными вирусами. Когда клетки движутся, в дополнение к стрессовым волокнам появляются топкие пучки актиновых нитей, рассеянные в цитоплазме; они особенно заметны в направленных вперед выступах клеток.
Рисунок 9. «Сеть микротрубочек, окрашенная мечеными антителами к тубулину в клетке культуры ткани в Gj -периоде». В клеточном центре желтым окрашена центриоль, связанная с антителами к γ -тубулину, Я – ядро.
4.2.1 Свойства актинов немышечных клеток
Актин широко распространен во всех эукариотических клетках. Его можно обнаружить как в растворимой мономерной форме, так и в полимерной — в виде филаментов. В некоторых активно передвигающихся клетках (амебы, макрофаги, тромбоциты) актин преобладает среди белков клеточного экстракта: его содержание может достигать 20—30% от общего белка, В менее подвижных клетках содержание актина заметно меньше—1—2% от общего белка. Однако если вспомнить, что в эукариотической клетке одновременно присутствуют многие, тысячи различных белков, то такое небольшое количество весьма существенно.
Благодаря относительно высокому его содержанию актин удается выделить из клеточных систем. Более акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Выявились три основных полипептида, один из которых соответствует актину. Два других белка (мол. массы 230 000 и 250000), по-видимому, ответственны за I поддержание актина в неполимеризованном состоянии. Обработка протеолитическим ферментом (трипсином) позволяет отделить мономерный актин от высокомолекулярных белков. Акросомальную реакцию у сперматозоидов Thyone можно вызвать различными актива- I торами; повышение, внутреннего рН освобождает актин от связанных с ним белков, делая тем самым возможной полимеризацию. Процесс полимеризации инициирует 1 специфическая структура, которую можно увидеть на дне акросомальной чаши и которая называется актомером. Она представляет собой пучок из примерно 25 коротких микрофиламентов, заключенный в плотное аморфное вещество. В момент активации актомер начинает действовать как ядро полимеризации, из которого вырастают микрофиламенты.
Па основании этих и других данных высказано предположение, что полимеризацией и ростом микрофиламентов управляют какие-то организующие центры, подобно тому, как центр, управляющий жгутиковым синтезом, регулирует сборку микротрубочек.
Специфические точки роста актиновых филаментов обнаружены в семенных клетках Mitylus и Limulus, a также при формировании кишечных ворсинок; вполне возможно, что они есть и во многих других объектах. Действительно, в немышечных клетках часто видно, что микрофиламенты прикреплены к определенным точкам клеточной мембраны, однако пока неясно, управляют ли эти точки сборкой микрофиламентов или же прикрепление к ним происходит уже после.
Рисунок 10. «Пучки актиновых микрофиламентов в клетках культуры ткани, окрашенных флуоресцирующими антителами Ядра – фиолетовые».
4.3 Микротрубочки, микрофиламенты и клеточные мембраны
Есть основания считать цитоплазматические микротрубочки и микрофиламенты тесно взаимосвязанными структурами одной и той же системы. Они играют сходную роль в генерации движения, встречаются в одних и тех же клетках в роли опорных структур, ведут себя сходным образом в зависимости от фазы клеточного цикла и образуют морфологически похожие структуры. К сожалению, приходится отметить, что, несмотря на приведенные выше соображения, у нас нет прямых доказательств взаимосвязи между микротрубочками и микрофиламентами. Многие данные, полученные различными методами, косвенно, но с большой вероятностью указывают на то, что между этими двумя системами есть связь, так что почти все признают, что такая связь на самом деле существует.
Например, с морфологической точки зрения исследовали распределение в клетке микротрубочек и микрофиламентов, особенно в процессе митоза. Фудживара и Поллард с помощью антител к тубулину, меченных флуоресцеином, и антител к миозину, меченных родамином, сравнили распределение микротрубочек и микрофиламентов в одной и той же клетке. В полностью распластанных клетках они не обнаружили морфологических связей между этими двумя типами волокон. Однако в митотическом веретене обусловленная миозином флуоресценция так сочеталась с флуоресценцией микротрубочек, что это указывало на тесную взаимосвязь между микрофиламентами и микротрубочками.
Более косвенные данные получены в опытах с ингибиторами микротубулярных структур (колхицин или его производное колцемид) и ингибиторами микрофиламентов (цитохалазин В). В качестве примера такого подхода мы рассмотрим влияние ингибиторов микротрубочек и микрофиламентов на явление образования «шапки» (capping), наблюдаемое в клетках млекопитающих. Реакция образования «шапки» возникает после обработки клетки бивалентными антителами или другими лигандами, способными взаимодействовать с белками на клеточной мембране. Она заключается в том, что связываемые молекулы лиганда скапливаются на ограниченном участке клеточной поверхности, образуя как бы шапку. Образование такой шапки угнетается цитохалазином-В, откуда следует, что микрофиламенты играют активную роль в перемещении молекул в мембране клетки. Во многих системах угнетение образования шапки удается снять колхицином или другими веществами, вызывающими деполимеризацию микротрубочек. Если разрушить и микротрубочки, и микрофиламенты комбинированным действием колхицина и цитохалазина-В, образовавшаяся шапка, которая обычно довольно стабильна, распадается, так что молекулы, из которых она состояла, распределяются по всей поверхности клетки. Эти результаты указывают на то, что и микротрубочки, и микрофиламенты участвуют в регуляции перемещения молекул в клеточной мембране: микрофиламенты проявляют сократительную активность, а микротрубочки служат для них опорой. Можно также предполагать, что для латерального перемещения белков в липидном бислое мембраны необходимо прямое взаимодействие между микрофиламентами и мембранными белками.
Есть, однако, и более прямые данные о том, что микрофиламенты соединены с поверхностными белками, т. е. с клеточными мембранами. В разных лабораториях различными методами показано, что непосредственно под шапкой, образующейся на лимфоцитах (после обработки антителами) или на клетках гранулезы яичников (после обработки конканавалином А), собирается много микрофиламентов. Там же накапливаются миозин и тубулин. В более поздней работе применили метод осаждения актина из лизатов клеток мышечным миозином, после чего идентифицировали вещество, преципитирующее вместе с актином; показано, что актин осаждается вместе с молекулами, обычно находящимися на внешней поверхности клеточных мембран, такими, как антигены Н-2 и иммуноглобулины. Количество иммуноглобулинов, связанных с актином, больше в клетках с «шапками», чем в клетках с неизмененным распределением антигенов по поверхности. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что агрегация поверхностных белков в «шапку» вызывается возникновением новых связей с актином. Это может служить дополнительным свидетельством в пользу того представления, что микрофиламенты контролируют, по крайней мере, некоторые типы перемещения компонентов мембраны.
Приведенные выше данные демонстрируют также, что актиновые филаменты прямо связаны с мембранами. Результаты, полученные с помощью других методов и на других объектах, также указывают на это. Например, микрофиламенты часто выделяются при очистке цитоплазматических мембран. Впервые это показано для Acanthamoeba caslellani , а впоследствии подтвердилось практически для всех типов клеток. В очищенных препаратах мембран микрофиламенты можно увидеть в электронный микроскоп (причем они прикреплены к внутренней поверхности мембраны); кроме того, при электрофорезе препаратов мембран в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия обнаруживается актин.
Далее, есть прямые микроскопические наблюдения примембранных областей, в которых много микрофиламентов. Иногда, например, в случае ворсинок, очень четко видно, что микрофиламенты прикреплены к мембране на конце ворсинки. На электронных микрофотографиях поперечных сколов ворсинок центральный пучок микрофиламентов соединен с мембраной ворсинки как бы спицей.
Как микрофиламенты прикрепляются к мембране, пока неясно. Непосредственно ли присоединены микрофиламенты к мембранам или же их связь осуществляется через какие-то другие белки? Второе предположение кажется более правдоподобным; наиболее вероятные кандидаты на роль такого связующего белка — а-актинин или подобные ему белки. Показано, что а-актинин присутствует в кончике ворсинки — там, где микрофиламенты прикрепляются к ее мембране; кроме того, он обнаружен в цитоплазматической мембране и в мембранах секреторных везикул вблизи микрофиламентов. Таким образом, предполагается, что α-актинин играет одну и ту же роль и в мышечных волокнах (где он связывает актиновые нити с Ζ-мембранами) и в немышечных клетках. Возможно, микрофиламенты взаимодействуют с мембранами также через посредство миозина, и есть данные, указывающие на то, что миозин может выступать как трансмембранный белок.
Менее убедительны эксперименты, поставленные с целью выявить прямое взаимодействие, между микротрубочками и мембранами. По данным многих исследователей, колхицин связывается с мембранами, однако из-за того, что такому связыванию могут способствовать самые разные факторы, это нельзя расценивать как доказательство присутствия тубулина в клеточной мембране. Более прямые данные, указывающие на то, что тубулин входит в состав мембран, получены на синаптосомах головного мозга и на мембранах ресничек некоторых моллюсков. Во всяком случае, связь с мембранами для тубулина, по-видимому, не столь обычное явление, как для актина.
Кратко рассмотрев данные о взаимодействиях между микротрубочками, микрофиламентами и мембранами, и помня о распределении элементов цитоскелета в животной клетке, мы можем обсудить роль цитоскелета и клеточной мембраны (рис. 11).
