Ввод образца был одной из первых проблем в масс-спектрометрии. Для проведения анализа масс образца, который первоначально находится при атмосферном давлении (760 Торр), он должен быть введён в прибор таким образом, чтобы вакуум внутри последнего остался практически неизменным (~10^-6 Торр). Основными методами ввода образца являются прямое введение

зонда или подложки, обычно используемое в MALDI-MS, или прямое вливание или впрыскивание в устройство ионизации, как в методе ESI-MS. [1]

Прямое введение : использование прямого введения зонда/подложки (рис. 1.3 ) – очень простой способ доставки образца в прибор. Образец сначала размещается на зонде, а затем вводится в ионизационную зону масс-спектрометра, обычно через вакуумный клапан. Образец после подвергается необходимым процедурам десорбции, таким как лазерная десорбция или прямое нагревание, чтобы обеспечить испарение и ионизацию.

Прямое вливание или впрыскивание : простой капилляр или капиллярная колонка используется для помещения образца в газообразной форме или в растворе. Прямое вливание также удобно, потому что оно позволяет эффективно вводить малые количества вещества в масс-спектрометр без нарушения вакуума. Капиллярные колонки обычно используются для разграничения систем разделения и устройства ионизации масс-спектрометра. Эти системы, включая газовую хроматографию (ГХ) и жидкостную хроматографию (ЖХ), также служат для разделения различных компонентов раствора, важных для анализа масс. В газовой хроматографии разделение различных компонентов происходит в стеклянной капиллярной колонке. Как только пары образца покидают хроматограф, они направляются прямиком в масс-спектрометр.

В 1980-х годах невозможность совместного использования жидкостной хроматографии (ЖХ) с масс-спектрометрией была обусловлена, большей частью, неспособностью устройств ионизации справляться с непрерывным по-

током ЖХ. Однако, ионизация электроспрея (ESI), химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI) и фотоионизация при атмосферном давлении (APPI) сейчас позволяют совмещать ЖХ и масс-спектрометрию в повседневных анализах.

Механизмы ионизации

Протонирование – механизм ионизации, при котором к молекуле присоединяется протон, сообщая ей заряд 1+ на каждый присоединённый протон. Положительные заряды обычно локализуются на основных частях молекулы, таких, как амины, с образованием стабильных катионов. Пептиды часто ионизируются при помощи протонирования. Протонирование осуществляется при MALDI, ESI и APCI.

Депротонирование– механизм ионизации, при котором отрицательный заряд 1- получается при отрыве протона от молекулы. Такой механизм ионизации обычно осуществляется при MALDI, ESI и APCI и очень полезен для определения кислотных образцов, включая фенолы, карбоновые кислоты и сульфоновые кислоты. Спектр отрицательных ионов сиаловой кислоты показан на рис 1.2 .

Катионизация – механизм ионизации, в котором заряженный комплекс образуется при координационном присоединении положительно заряженного иона к нейтральной молекуле. В принципе, пртонирование тоже подпадает под это определение, поэтому катионизацией считается присоединение иона, отличного от протона, например щелочного металла или аммония. Кроме того, катионизация применима к молекулам, которые неспособны к протонированию. Связь катионов, в отличие от протонов, с молекулой менее ковалентна, поэтому заряд остаётся локализован на катионе. Это минимизирует размывание заряда и фрагментацию молекулы. Катионизация также может быть произведена при MALDI, ESI и APCI. Углеводы – лучшие вещества для такого механизма ионизации, с Na⁺ как обычным присоединённым катионом.

Прямой перенос заряженной молекулы в газовую фазу

Перенос соединений, уже заряженных в растворе, легко достигается при использовании десорбции или выбрасыванием заряженных частиц из конденсированной фазы в газовую. Обычно это осуществляется с использованием MALDI или ESI.

Отрыв электрона

Как видно из названия механизма, отрыв электрона придаёт молекуле 1+ положительный заряд при выбивании электрона, так что при этом часто образуются катион-радикалы. Наблюдаемый, в основном, при электронной ионизации, отрыв электрона обычно применяется для относительно неполярных соединений с низкой молекулярной массой. Также известно, что он часто приводит к образованию значительных количеств фрагментарных ионов.

Захват электрона

При захвате электрона, отрицательный заряд 1- сообщается молекуле при присоединении электрона. Этот механизм ионизации в первую очередь наблюдается для молекул с большим сродством к электрону, таких как галогенсодержащие соединения.

Таблица 1.1. Механизмы ионизации, их преимущества и недостатки.

Механизм ионизации	Преимущества	Недостатки
Протонирование (положительные ионы)	· многие соединения присоединяют протон с получением заряда · многие способы ионизации, такие, как ESI, APCI, FAB, CI и MALDI производят такие частицы	· многие соединения нестабильны в протонированной форме (например, углеводы) или с трудом присоединяют протон (например, углеводороды)
Катионизация (положительные ионы)	· многие соединения присоединяют катион, такой как Na+ или K+ с получением заряда · многие способы ионизации, такие, как ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы	· опыты тандемной масс-спектрометрии на катионизированных молекулах часто дают очень ограниченную информацию по фрагментации
Депротонирование (отрицательные ионы)	· многие полезные вещества в какой-то мере являются кислотами · многие способы ионизации, такие, как ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы	· применимо только для специфических соединений
Перенос заряженных молекул в газовую фазу (положительные и отрицательные ионы)	· полезно для соединений, которые уже заряжены · многие способы ионизации, такие, как ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы	· применимо только для уже заряженных частиц
Отрыв электрона (положительные ионы)	· наблюдается при электронной ионизации и даёт информацию не только о молекулярной массе, но и информацию о фрагментарных ионах	· часто производит слишком сильную фрагментацию · может быть непонятно, является ли ион с наибольшей массой молекулярным ионом или же фрагментом
Захват электрона (отрицательные ионы)	· наблюдается при электронной ионизации и даёт информацию не только о молекулярной массе, но и информацию о фрагментарных ионах	· часто производит слишком сильную фрагментацию · может быть непонятно, является ли ион с наибольшей массой молекулярным ионом или же фрагментом

Способы ионизации

Вплоть до 1980-х электронная ионизация (EI) была основным способом ионизации для анализа масс. Однако EI ограничивала химиков и биохимиков малыми молекулами, масса которых намного ниже массы большинства биоорганических соединений. Это ограничений побудило таких учёных, как Дж. Б. Фенн, К. Танака, Ф. Хилленкамп, М. Карас, Г. Кукс и М. Барбер, разработать новое поколение способов ионизации, включая бомбардировку быстрыми атомами/ионами (FAB), лазерную ионизацию при помощи матрицы (MALDI) и ионизацию электроспрея (таблица 1.2 ). Эти способы совершили революцию в биомолекулярном анализе, особенно для больших молекул. Среди них, ESI и MALDI стали по-настоящему «избранными», когда дело касается биомолекулярного анализа.

Таблица 1.2.

Способ ионизации	Аббревиатура	События
Ионизация электроспрея	ESI	испарение заряженных капель
Ионизация наноэлектроспрея	nanoESI
Химическая ионизация при атмосферном давлении	APCI	коронный разряд и перенос протона
Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы	MALDI	поглощение фотона/перенос протона
Десорбция/ионизация на кремнии	DIOS
Бомбардировка быстрыми атомами/ионами	FAB	десорбция иона/перенос протона
Электронная ионизация	EI	пучок электронов/перенос электрона
Химическая ионизация	CI	перенос протона

MALDI ? ESI ?????? ???????? ?????? ????????????????? ????????? ????????? ??? ??????????????? ????-?????????????, ? ?? ????????????? ??????????? ???? ? ????????????????? (рис. 1. 3 ). ????????? ?????? ????? ???????? ??????? ???????? ?????????, ???????????? ????????? ?????? ? ???????????? ???????? ?? ?????????? ?????? ? ??????????? ?????????.

Ионизация электроспрея (ESI)

Идея электроспрея, хоть и не нова, была возрождена в связи с её настоящим применением к биомолекулам. Первые эксперименты с электроспреем были проведены Чепменом в поздних 1930-х, а практическое развитие ионизации электроспрея для масс-спектрометрии было завершено Доулом в поздних 1960-х. Доул также открыл важное явление множественной зарядки молекул. Работы Фенна окончательно привели к современной технике ионизации электроспрея в масс-спектрометрии и её применению для биологических молекул.