Курсовая работа: Методы изучения наследственности человека
Учет хромосомных аберраций. Изменение числа и структуры хромосом в соматических клетках и зародышевых клетках могут возникать спонтанно или после воздействия физическими и химическими агентами. Нарушения хромосом, возникающие в зародышевых клетках, приводят к разнообразной врожденной патологии у человека. Эти нарушения принято относить к мутациям, которые могут быть разделены на геномные в случае изменения числа хромосом и хромосомные – при структурных нарушениях.
Многочисленные работы последних лет свидетельствуют о том, что накопление хромосомных мутаций в соматических клетках является одним из факторов, индуцирующих развитие клонов злокачественных клеток, а также процессы старения.
Анализ хромосом соматических клеток методически хорошо разработан. Аномалии хромосом в экспериментальных условиях можно индуцировать различными агентами в клеточных культурах и в соматических клетках лабораторных животных in vivo. В последнем случае обычно в качестве модели используют клетки костного мозга животных.
Все хромосомные аберрации, возникающие в соматических клетках человека и животных, учитываемых на стадии метафазы, разделяют на 2 основные группы: хромосомные и хроматидные. Отнесение той или иной аберрации к хромосомному или хроматидному типу зависит от того, на каком уровне (хромосомы или хроматиды) повреждена хромосома, включенная в перестройку.
Аберрации хромосомного типа отражают повреждение хромосомы на предсинтетической стадии (G1-фаза), когда она представляет собой однонитевую структуру, тогда как аберрации хроматидного типа возникают при повреждении хромосомы на двунитчатой стадии, то есть в фазе S и G2. Нередко при повреждении обеих хроматид хромосомы в идентичных локусах возникают изохроматидные разрывы, морфологически неотличимые от аберраций хроматидного типа. Аберрации могут быть простыми и обменными. Нарушение целостности одной или нескольких хромосом с образованием свободных или связанных с ней фрагментов относят к простому типу аберраций, тогда как перестройка участков одной и той же хромосомы или перекомбинации участками между несколькими хромосомами – к обменному типу.
Обменные аберрации могут быть внутрихромосомными и межхромосомными. В зависимости от локализации внутрихромосомные аберрации разделяют на внутриплечевые и межплечевые. При межхромосомных обменах, если ацентрические фрагменты соединяются с центрическими, то обмены классифицируют как симметричные, а в случае соединения центрических фрагментов – как асимметричные. В последнем случае обмен характеризуется появлением полицентрических хромосом и хроматид. Внутрихромосомные и межхромосомные обмены могут быть полными и неполными. При полных обменах происходит воссоединение всех перекомбинирующихся участков поврежденных хромосом[3] .
Культура лейкоцитов человека широко используется для изучения радиационного и химического мутагенеза у человека. Изменения лейкоцитов периферической крови человека в процессе культивирования в присутствии ФГА достаточно исследованы.
При таком культивировании происходит гибель всех форм лейкоцитов за исключением малых лимфоцитов, которые претерпевают изменения, приводящие к митозу. Поэтому при анализе митотических клеток, по существу, имеем дело с культурой лимфоцитов.
К достоинствам культуры лимфоцитов человека относятся доступность материала, синхронность клеточной популяции, низкий уровень спонтанного мутирования, отработанность техники культивирования и изученность морфологии хромосом.
Для целей тестирования используют микро- или полумикрометод культуры лимфоцитов. Анализ хромосом проводят на метафазных пластинках с хорошо окрашенными и разбросанными хромосомами. При этом метафазные пластинки не должны иметь большое количество наложений хромосом и уровень конденсации их должен быть таким, чтобы акроцентрические хромосомы были видны в виде четко выраженных структур. Но анализируются метафазные пластинки с хромосомами, вошедшими в анафазу, так как трудно дифференцировать их от парных фрагментов. Из-за технических манипуляций возможны потери хромосом в пластинке. Поэтому при учете хромосомных аберраций обычно анализируется клетка с числом хромосом от 44 до 47.
При тестировании химических соединений на мутагенную активность хромосомные аберрации учитывают без кариотипирования. Кариотипирование метафазной пластинки применяют в специальных исследованиях, например, при изучении распределения повреждений по группам хромосом, их длине.
Долгое время спорным являлся учет пробелов (брешей) в качестве аберраций. В настоящее время принято пробелы регистрировать отдельно, не включая их в число учитываемых аберраций. Частота пробелов в значительной степени зависит от качества окраски и степени спирализации хромосом.
О мутагенной активности судят по частоте хромосомных аберраций, превышающей спонтанный уровень в норме. Типы индуцированных химическими мутагенами аберраций, как правило, аналогичны типам спонтанных аберраций.
При тестировании химических соединений эксперименты проводят в два этапа. Первый этап предполагает обнаружение возможного эффекта вещества в максимальной концентрации, обработку культур проводят на 48 часу роста и фиксируют клетки на 72 часу. При наличии эффекта переходят к изучению зависимости доза-эффект (2-й этап).
Костный мозг млекопитающих является наиболее широко используемой моделью для исследования мутагенной активности химических соединений in vivo. Это связано, во-первых, с тем, что клетки костного мозга имеют высокую пролиферативную активность и, во-вторых, простотой приготовления препаратов. Морфология хромосом большинства видов лабораторных животных хорошо изучена.
Тестирование обычно проводят на мышах, анализируют и учитывают как число метафаз с аберрациями, так и общее число структурных нарушений хромосом.
Клетки костного мозга асинхронны и для установления наиболее чувствительной стадии клеточного цикла анализируют различные клеточные популяции, зафиксированные в различные сроки после воздействия. Рекомендуют фиксировать клетки через 6, 24 и 48 часов после введения животным тестируемого агента.
Уровень хромосомных аберраций в клетках костного мозга достаточно низок и составляет у большинства линий лабораторных мышей 1-2%.
Для работы обычно выбирают линии с низкой и стабильной частотой (=1%) спонтанных аберраций. Мыши CBA/L acY, F1(C3Hx101) и F1(CBAxC57 BL/6) имеют низкий уровень спонтанных аберраций. Однако они по чувствительности к действию ряда мутагенов существенно отличаются друг от друга.
Метод учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих является составной частью практически всех комплексов методов оценки мутагенных свойств у химических веществ, принятых почти во всех странах мира проводящих такую оценку.
Сестринские хроматидные обмены. Феномен обмена участками между сестринскими хроматидами одной хромосомы привлек внимание исследователей мутагенных факторов окружающей среды своей высокой чувствительностью. Так, изучение уровней индукции СХО и хромосомных аберраций при действии 5 мутагенными агентами на лимфоциты человека in vitro и на клетки костного мозга мышей in vivo показало, что эффективность индукции СХО in vitro в 300-30 раз превышает эффективность образования аберраций хромосом. Та же закономерность сохранялась при действии in vivo, но соотношение снижалось до 60-20 раз (Щеглова Е.Г., Чеботарева А.Н., 1985).
Принцип метода обнаружения СХО заключается в воздействии на клетки таким образом, чтобы две сестринские хроматиды отличались друг от друга. Достигается это введением в растущую культуру клеток 5-бромдезоксиуридина (БДУ) с последующей окраской препаратов. БДУ присутствуют в среде в течение двух клеточных циклов. Хроматиды, включившие БДУ в обе субъединицы, выглядят на окрашенных препаратах более светлыми, чем хроматиды, включившие его в одну субъединицу или не включившие вообще. Данный подход был предложен А.Ф.Захаровым и Н.А.Еголиной (1972) и является основой всех современных методов обнаружения СХО, так как все последующие разработки сводятся лишь к использованию различных красителей для различения двух сестринских хроматид, в разной степени включивших БДУ[4] .
Природа СХО до сих пор остается не выясненной и этой проблеме посвящено много работ. Основной вопрос заключается в том, что следует ли считать СХО прямым генетическим эффектом или следствием определенных типов повреждений ДНК. В этой связи понятен интерес исследователей к выяснению взаимосвязи между СХО, мутагенезом и повреждениями ДНК.
Клетки китайского хомячка V 79 обрабатывали различными химическими веществами и исследовали взаимосвязь между повреждениями ДНК, токсичностью, мутагенностью и индукцией СХО. Транс-Pt (II) диаминодихлорид, не являющийся мутагеном, приводил к образованию почти такого же количества СХО, как и высокомутагенный цис-Pt (II) диаминдихлорид. Поскольку эти препараты не приводят к образованию однонитевых разрывов в ДНК, то можно было предположить, что СХО является следствием каких-то других повреждений, например, сшивок ДНК-ДНК или ДНК-белок. Транс-Pt (II) образует почти в 20 раз больше сшивок ДНК-белок, чем цис-Pt (II), однако количество сшивок ДНК-ДНК в этих случаях одинаково. Таким образом, было показано, что существует более тесная связь между СХО и сшивками ДНК-ДНК. В этой же работе тесной связи между частотой СХО, мутагенностью