Курсовая работа: Молекулярная палеонтология и эволюционные представления о возрасте ископаемых останков

Ваш покорный слуга, хотя и получал антисыворотку и делал аналогичные вещи в области определения белков иммунохимическими методами, все-таки не является конкретно иммунохимиком. И тем не менее позволю себе сделать следующий вывод. Чтобы антисыворотка к каким-то белковым фрагментам, выделенным из той кости тиранозавра, "работала" так, как это наблюдалось у авторов [8], она все-таки должна была иметь ощутимый титр (концентрацию) антител. Поэтому и иммуногенность вводимых крысам полипептидов была достаточно ощутима, а, значит, и их молекулярная масса (длина молекулы) — тоже. Полагаю, что величина последней составляла никак не менее 2000–3000 у.е., что соответствует цепочке из порядка 15–20 аминокислотных остатков.

Указанный вывод косвенно следует в том числе и из руководств по иммунохимическим методам анализа (например [42]).

Далее авторы [8], использовав полученную антисыворотку, с помощью двух иммунохимических методов определили, реагирует ли она с препаратами гемоглобинов (коммерческих, выпускаемых химическими фирмами) из различных источников. При иммуноферментном анализе в растворе (ELISA) было обнаружено, что антисыворотка отчетливо "узнает" гемоглобин индюка, а с помощью иммуноблоттинга (это на специальной мембране) получены еще более исчерпывающие данные.

В [8] проделаны все стандартные контроли и представлен почти весь первичный экспериментальный иллюстративный материал. Перед иммуноблоттингом авторы убедились, что имеющиеся у них стандартные препараты гемоглобинов кролика, индюка и змеи вполне качественные. Действительно, хотя и закупленные, наверное, на крупных химических фирмах (в статье не указано, но вряд ли сами очищали), такие препараты могут портиться при хранении даже в холодильнике (микробы съедят, вода попадет). Это вам не доказывать, что выделенным не распавшимся фрагментам белка тиранозавра миллионы лет. Попробуй не убедись, что твои стандартные препараты современных белков не развалились у тебя (частично, конечно) при хранении в течение нескольких лет, или же при неаккуратной транспортировке с фирмы (когда лед положить забыли), и коллеги-биохимики могут указать на возможность некорректности и артефактов, посмотрев полученные тобой данные.

Это только у тиранозавра его полипептиды десятки миллионов лет нераспадаться способны.

Как бы там ни было, перед иммуноблоттингом авторы провели электрофорез своих стандартных гемоглобинов (электрофореграмма представлена) и убедились, что все они имеют присущую гемоглобинам молекулярную массу (порядка 64.000), то есть, что препараты "не развалились".

После этого проводили их иммуноблоттинг с антисывороткой к белковому экстракту из кости тиранозавра и обнаружили отчетливую (во всяком случае, на фото) реакцию с гемоглобинами кролика и индюка. А вот с гемоглобином змеи антитела не реагировали, и это послужило контролем того, что антитела связываются не с любым белком. Если бы антитела "узнали" еще и гемоглобин змеи, то авторам пришлось бы для контроля исследовать реакцию с еще каким-нибудь белком, не гемоглобином (с альбумином, к примеру). Чтобы сказать: да, реакция характерна не просто для белков как таковых, а именно и только для гемоглобинов.

Но в молекуле гемоглобина змеи не оказалось того участка аминокислотной последовательности, который соответствовал фрагментам гемоглобина тиранозавра, в то время как в гемоглобинах индюка и кролика он имелся. Антитела не среагировали с гемоглобином змеи, и, поэтому, авторам повезло: не пришлось проводить дополнительное исследование реакции с каким-нибудь другим, неспецифическим белком. В качестве его случайно выступил гемоглобин змеи.

С первого взгляда кажется странным: антитела к белку тиранозавра, а реагируют с гемоглобином кролика, но не змеи. Но это и не важно: просто такой участок полипептидной последовательности во фрагментах весьма распавшегося гемоглобина тиранозавра попался, которого нет в белке змеи. Тем более, что он имеется в гемоглобине птицы (индюка), а именно к птицам ящеры типа тиранозавра и близки [10, 11].

Авторы [8] проделали также иммуноблоттинг с экстрактами из бактерий и даже из окружавшего кость песчаника, но антитела со всем этим, конечно, не среагировали. Таким образом, почти все мыслимые контроли были соблюдены.

Однако идентификацией белковой части фрагментов гемоглобина тиранозавра М. Швейцер с соавторами похвально не ограничились. В состав молекулы гемоглобина входит специфичное молекулярное образование — гем: железо в особой координационной форме в связи с порфирином (это кольцевая структура; грубо говоря, что-то типа нескольких бензолов). Авторы [8] для идентификации специфической структуры гема в экстрактах из костей динозавра применили целый комплекс из пяти физико-химических методов: ЯМР, спектроскопию в ультрафиолете, ЭПР, HPLC и др. (не станем подробно рассматривать суть этих известных методов). Было обнаружено, что во всех случаях полученные показатели характерны для гема.

Кроме того, в местах локализации структур, соответствующих сосудам внутри костей, окраска была характерной для остатков крови (красно-коричневая). Такую же окраску имел и белковый экстракт [8, 16].

Это все, но этого вполне хватает, чтобы сделать следующие выводы:

1) Работа проведена корректно; использованные подходы адекватны, а полученные данные убедительны.

2) Найдены остатки специфичной структуры гема в участках сосудистой стенки кости тиранозавра.

3) Строго идентифицированы белковые фрагменты молекулы именно гемоглобина тиранозавра возрастом "65 млн. лет".

4) Эти фрагменты, хотя и малы, вряд ли состоят из менее чем 15–20 аминокислотных остатков, что составляет 3–5% от интактной (исходной) молекулы гемоглобина. В самом теоретически "худшем" случае фрагменты не могут включать менее 7–8 аминокислот (2% от интактной молекулы), но этот случай весьма проблематичен, исходя из их ощутимой иммуногенности. В наиболее же "лучшем" теоретически случае фрагменты не могут быть длиной более 40–70 аминокислот (10–15% от интактного белка), поскольку не видны при электрофорезе.

Таким образом, гемоглобин тиранозавра за "65 млн. лет" почему-то не распался на все 100%