- нарушения менструальной и генеративной функций, в том числе привычное невынашивание беременности;

- наличие в семье или в родословной ребенка с врожденным пороком развития, хромосомным и моногенным синдромом, антенатальная гибель плода, мертворождение;

- неблагоприятные воздействия на плод во время беременности (лекарственные препараты, вирусная и бактериальная инфекция, прием алкоголя, наркотиков, проф. вредности и пр.);

- сочетание беременности и экстрагенитальной патологии;

- уточнение диагноза наследственного заболевания;

- прочие сочетанные показания.

Современная пренатальная диагностика состоит как минимум из 3 этапов:

I этап - медико-генетическое консультирование, во время которого формируется группа высокого риска по врожденной и наследственной патологии плода;

II этап – скринирующий - предусматривает обследование всех или почти всех беременных с помощью неинвазивных методов: ультразвукового сканирования и анализа маркерных сывороточных белков α-фенопротеина (АФП), хорионического гонадотропина (ХГ) в крови в наиболее информативные сроки;

III этап - инвазивная пренатальная диагностика для точного определения хромосомных и ряда моногенных заболеваний плода.

Цель настоящего обзора: анализ как существующих методических подходов в пренатальной диагностике (ПД) хромосомопатий, так и ее принципиально новых направлении.

2 Пренатальная диагностика наследственных болезней

Предимплантационная генетическая диагностика (ПГД) представляет собой совокупность методов, позволяющих проводить анализ наследственных заболеваний у эмбриона до его имплантации. Благодаря такой диагностике супружеские пары, имеющие риск передачи по наследству генетической патологии, получают возможность родить здорового ребенка.

У делящегося эмбриона invitro осуществляют биопсию одной или двух клеток (бластомеров), что не влияет на его жизнеспособность. На этом материале проводят диагностику различных наследственных заболеваний. Если исследованная клетка не содержит генетических аномалий, эмбрион считают здоровым и его можно имплантировать матери. Таким образом, в результате ПГД снижается риск развития определенных генетических заболеваний, что позволяет рассматривать этот вид исследования как альтернативу пренатальной диагностике при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО).

В настоящее время более чем в 50% случаев ПГД проводят с использованием молекулярно-цитогенетических методов с целью обнаружения анеуплоидии по хромосомам 13, 16, 18, 21, 22, X и V как наиболее частой генетической аномалии, выявляемой у эмбрионов. Использование метода FISH на интерфазном ядре позволяет выявить численную патологию хромосом у эмбриона.

Более сложной задачей является обнаружение патологии кариотипа, возникающей в результате сбалансированных структурных хромосомных аномалий (транслокаций, инверсий, инсерций) у родителей. Эта задача решается путем получения специфических ДНК-зондов практически на все хромосомные районы и проведения FISH-анализа. Возможно также использование таких методов молекулярной цитогенетики, как полное окрашивание флюорохромом аномальной хромосомы (chromosomepainting), использование множественного флюоресцентного кариотипирования (M-F1SH), спектроскопического анализа кариотипа (SKY-FISH) и сравнительной геномной гибридизации. Однако проблема заключается в том, что указанные методы исследования трудоемки, дорогостоящи, требуют значительных временных затрат и позволяют выявить только хромосомную патологию. Кроме того, необходимо учитывать технические моменты хромосомного анализа:

1) потеря единственной клетки во время фиксации;

2) неполное удаление цитоплазмы, что может повлиять на эффективность гибридизации и интерпретацию результатов;

3) недостаточная распространенность хроматина, что может привести к наложению гибридизационных сигналов;

4) потеря микроядер, в результате чего возможно ложное заключение о наличии моносомии.

Одним из методов, позволяющих не только оценить кариотип эмбриона, но и провести ДНК-диагностику, является последовательный FISH- и ПЦР-анализ на единственной фиксированной клетке.

Биопсия материала для диагностики в сочетании с технологиями ПЦР проводится на 3-й день после оплодотворения, когда эмбрион содержит от 6 до 10 бластомеров. На этой стадии бластомеры являются полипотентными, и процедура биопсии не оказывает отрицательного влияния на жизнеспособность эмбриона. Оптимальным является анализ 1 - 2 бластомеров. В настоящее время биопсия бластомеров является современным подходом для ПГД и может использоваться в клинической практике.

3 Основные проблемы молекулярной ПГД

Возможности ПЦР в увеличении малого количества ДНК до уровня, на котором его можно визуализировать и осуществить генетический анализ, делает этот метод приоритетным для ДНК-диагностики. Применение ПЦР дли анализа единственной клетки является трудной, но реально осуществляемой задачей и остается методом выбора для определения специфических генных мутаций у эмбрионов человека перед имплантацией.

Основным ограничивающим фактором при проведении ПГД является малое количество ДНК, используемое в качестве матрицы для ПЦР - примерно 7 пг (7*10^-12 ), что соответствует количеству ДНК одной диплоидной клетки, тогда как предел чувствительности метода ПЦР равен примерно 10 нг ДНК (1*10^-9 ).

В связи с этим основными проблемами протокола ПЦР для анализа единственной клетки являются:

1) увеличение количества ДНК до величины, необходимой для анализа;

2) предупреждение и исключение контаминации;

3) преимущественная амплификация или выпадение одного аллеля в гетерозиготных образцах.

3.1 Характеристика ПЦР единственной клетки. Эффективность амплификации

Эффективность ПЦР единственной клетки значительно ниже, чем обычной ПЦР, в которой количество ДНК-матрицы может быть в несколько раз больше. Снижение эффективности метода может происходить в результате разнообразных причин, касающихся как образца, так и самой процедуры ПЦР. К операционным проблемам относят потерю материала во время переноса клетки в пробирку или внезапный лизис до помещения клетки в пробирку, что снижает эффективность амплификации или приводит к ее отсутствию. Внутренние факторы заключаются в отсутствии ядра, дегенерации клетки с потерей или деградацией ДНК. Эти факторы контролировать значительно сложнее. На эффективность ПЦР, кроме процедуры переноса высококачественной ядросодержащей клетки, также влияет качественный лизис клетки с целью получения ДНК-матрицы.