Рисунок 7. Схема, иллюстрирующая возможную роль специфических последовательностей ДНК (показаны цветными), расположенных «ниже» V -сегмента и «выше» J -сегмента, в соединении V - J . Взаимодействие между этими последовательностями, вероятно, происходит при участии сайт-специфической рекомбинационной системы, катализирующей разрыв и воссоединение двойных спиралей ДНК в области этих последовательностей.

Разнообразие антител увеличивается благодаря соматической рекомбинации, соединению легких и тяжелых цепей в различных сочетаниях и возникновению соматических мутаций. В процессе эволюции иммунной системы выработался целый ряд различных механизмов, приводящих к большому разнообразию антиген-связывающих участков антител. Только часть из этих механизмов связана с описан выше соматическими перестройками ДНК в ходе развития В-лимфоцитов. Эксперименты по подсчету числа генов с использованием метода гибридизации ДНК показывают, что в геноме мыши, видимо, содержится несколько сотен V_х -сегментов, сходное число Vн-сегментов и два V_λ -сегмента. Из этого можно вычислить, что путем комбинированы личных унаследованных V-, D- и J-сегментов у мыши может образоваться по меньшей мере 10000 разных Vн-областей и 1000 разных V_L -областей.

Один простой, но весьма важный механизм, сильно увеличивающий разнообразие антител, состоит в комбинировании различных L- и Н-цепей. Поскольку в антиген-связывающий участок антитела вносят вклад как L-, так и Н-цепи, у животного с 1000 генов, кодирующих Vl-o6ласти, и с 10000 генов, кодирующих Vн-области, продукты этих генов могли бы образовать 1000 х 1000 различных комбинаций, т.е. 10⁷ разных антиген-связывающих участков, если предположить, что при этом любая L-цепь может сочетаться с любой Н-цепью.

Недавно было показано, что в генах V-области и поблизости от них происходят соматические мутации; вероятно, это увеличивает число разных антител по крайней мере в 10-100 раз. Механизмы, благодаря которым мутации возникают именно здесь, неизвестны. Однако было обнаружено, что мутации встречаются гораздо чаще в антителах IgG и IgA, чем в кодируемых Vн-геном антителах IgM. Это, пожалуй, неудивительно, так как молекулы IgM вырабатываются на ранних стадиях иммунного ответа, aIgG и IgА появляются относительно поздно. Поэтому В-клетки, переключившиеся на IgG или IgA, как правило, претерпели большее число делений, чем В-клетки, продолжающие вырабатывать IgM, и поэтому, скорее всего, накопили больше мутаций. С другой стороны, может существовать механизм, повышающий частоту мутирования V-генов после того, как произойдет переключение с IgM на иммуноглобулины других классов. Как бы было, изменение антиген-связывающих участков в результате соматических мутаций может вести к тому, что антиген будет особенно эффективно вызывать пролиферацию тех В-клеток, у которых измененные антитела приобрели высокое сродство к антигену; возможно, что именно этим (по крайней мере отчасти) объясняется повышение сродства антител, наблюдаемое после иммунизации (созревание сродства). Таким образом, соматические мутации могут не только увеличивать разнообразие антител, но и служить для тонкой подстройки антител при иммунном ответе.

Механизмы экспрессии генов антител обеспечивают моноспецифичность В-клеток

Теория клональной селекции предсказала, а разнообразные эксперименты подтвердили, что отдельные В-клетки моноспецифичны, т.е. вырабатывают антитела с антиген-связывающим участком только одного типа. Значит, должен существовать какой-то механизм, ограничивающий возможности активации иммуноглобулиновых генов в индивидуальных В-клетках, так что эти клетки могут вырабатывать только один тип L-цепи и один тип Н-цепи. Например, В-клетка не может одновременно производить легкие цепи х и λ, и поддерживать при этом моноспецифичность, так как эти две цепи почти всегда имели бы разные вариабельные области и потому образовывали бы молекулы антител с антиген-связывающими участками более чем одного вида. Действительно, в каждой В-клетке активируется либо один, либо другой из этих генных пулов, но никогда не активируются оба пула одновременно.

Более того, поскольку В-клетки (как все соматические клетки) диплоидны, каждая из них имеет шесть генных пулов, кодирующих антитела: по одному пулу для Н-цепи, для λ-цепи и для х-цепи от каждого из родителей. Моноспецифичность В-клеток означает, что в каждой клетке должны активироваться гены только двух из этих шести пулов – один из четырех генных пулов легких цепей и один из двух генных пулов тяжелых цепей. Таким образом, В-клетка должна делать выбор не только между х и λ, но также и между материнскими и отцовскими генными пулами. Экспрессия только материнского или только отцовского аллеля гена Ig в любой данной В-клетке называется аллельным исключением. Материнские и отцовские аутосомные гены для других белков экспрессируются в клетке приблизительно одинаково. У позвоночных из этой закономерности выпадает (кроме генов иммуноглобулинов) только инактивация одной из двух Х-хромосом у самок.

Почему важно, чтобы В-клетки были моноспецифичны? Моноспецифичность гарантирует, что каждая молекула антитела будет составлена из двух идентичных половинок и поэтому будет содержать два идентичных антиген-связывающих участка. По-видимому, это свойство выработалось в процессе эволюции потому, что оно наделяет антитела способностью образовывать обширные сети из сшитых антигенов. Механизмы, участвующие в аллельном исключении и в выборе одного типа L-цепей в ходе развития В-клеток, неизвестны. Одна из очевидных возможностей состоит в том, что в неэкспрессируемых генных пулах сегменты генов антител просто не подвергаются перегруппировке. Однако уже получены убедительные данные о том, что это не так. Часто в неэкспрессируемых хромосомах перестройки происходят, но неправильным образом и поэтому не могут обеспечить синтез цепей Ig, пригодных для построения антител. Это наводит на мысль, что, может быть, соединение сегментов генов V-области в ходе развития В-клеток – в известной степени случайный процесс, чаще приводящий к непродуктивным перестройкам, чем к продуктивным. В этом случае аллельное исключение могло бы быть просто результатом того, что очень низка вероятность успешной перестройки в более чем одном генном пуле для каждой цепи. Но это означало бы, что во многих клетках вообще не будет успешной перестройки и, следовательно, синтеза антител. Поскольку такие клетки не будут стимулироваться никаким антигеном, они должны быстро погибать. Подобный механизм представляется весьма расточительным, однако это может быть расплатой за моноспецифичность.

Переключение синтеза с мембраносвязанной на секретируемую форму одного и того же антитела происходит путем изменения РНК-транскриптов для Н‑цепи

Рассмотрев генетические механизмы, от которых зависит структура антиген- связывающего участка, мы перейдем теперь к механизмам, определяющим биологические свойства антитела, т. е. тип константной области тяжелой ветви. Если однажды сделанный выбор определенных сегментов ДНК для кодирования антиген-связывающего участка является окончательным и для В-клетки, и для ее потомков, то тип синтезируемой Сн-области может изме- няться в процессе развития клетки.

Антитела всех классов могут синтезироваться как в мембраносвязанной, так и в растворимой, секретируемой Мембрано-связанные антитела служат рецепторами для антигена на поверхности В-клеток. После стимуляции клетки антигеном те же самые антитела вырабатываются в секретируемой форме. В случае IgM эти две формы разли- чаются только С-концевым участком μ-цепи: у мембраносвязанных антител μ -цепь оканчивается гидрофобным участком, закрепляющим ее в липидном бислое плазматической мембраны В-клетки, тогда как у секретируемых анти- тел IgM имеется вместо этого гидрофильный «хвост», позволяющий молеку- лам выходить из клетки. Способность В-клеток производить μ-цепи с константными областями двух различных типов сначала казалась парадоксальной, так как В-клетки содержат лишь одну копию гена С„ на гаплоидный геном.

Парадокс был разрешен, когда выяснилось, что активация В-клеток приводит к изменению ядерных РНК-транскриптов для μ-цепи: эти транскрипты несколько короче тех, которые кодировали мембраносвязанную μ-цепь.

В-клетки могут переключаться с выработки одного класса антител на выработку другого

Переключение синтеза с мембраносвязанной формы антител на секретируемую форму – не единственный вид изменений, которые могут происходить в С-области тяжелой цепи в ходе развития В-клеток. Все В-клетки начинают свою деятельность по синтезу антител с выработки IgM, но многие из них затем переключаются на выработку антител других классов, например IgG или IgA. Этот процесс называют переключением класса. Способность В-клеток изменять вырабатываемый ими класс антител без изменения антиген-связывающего участка означает, что один и тот же собранный Vн-ген может последовательно ассоциироваться с разными Сн-генами.

По-видимому, процесс переключения класса состоит из двух последовательных этапов. Сначала клетка, производящая мембраносвязанный IgM, может переключиться на одновременную выработку мембраносвязанного IgM и мембраносвязанной формы антител другого класса, например IgD. Как полагают, такая В-клетка продуцирует длинные первичные РНК-транскрипты, содержащие наряду с собранной последовательностью Vн-области как С_μ , так и С_δ -последовательности. Такие транскрипты подвергаются затем сплайсингу двумя различными способами, приводящими к двум разным видам молекул мРНК. Оба вида кодируют одну и ту же V_н -область, но один вид содержит С_μ -, а другой - С_δ -последовательность. Вероятно, тот же механизм действует при переключении В-клетки на одновременную выработку мембраносвязанных форм IgM и одного из других ?