Курсовая работа: Получение рекомбинантного аденовируса CELO
Введение
Проблема изучения структуры и функции ДНК, а также возможности ее искусственного изменения и создания организмов с заданными наследственными свойствами - одна из центральных задач биотехнологии.
Предлагаемая курсовая работа структурно состоит из двух частей: первая содержит литературный обзор наиболее важных положений учения о ДНК и характеризует современное видение проблемы. Вторая часть научно- исследовательская, выполненная автором на базе Государственного НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва) с целью получения плазмиды, пригодной для создания рекомбинантных аденовирусов.
Первая часть выполнена под руководством профессора Н.С. Колобелина (Воронежская государственная биофабрика), вторая часть под руководством канд. биологических наук, старшего научного сотрудника Д.Ю. Логинова (ГУНИИ ЭМ им. Гамалеи, г. Москва).
25 апреля 1953 г. в журнале «Nature» были напечатаны две заметки. Авторы первой из них, названной «Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты», - 25-тилетний американский биохимик Джеймс Уотсон и 37-тилетний английский биофизик Фрэнсис Крик на полутора страницах описали знаменитую двойную спираль и попытались объяснить, как молекуле ДНК удаётся добиться такой точности самовоспроизведения.
В другой статье ровесник, соотечественник и коллега Крика Морис Уилкинс с соавторами опубликовал высококачественные рентгенограммы молекулы ДНК, которые подтверждали гипотезу её «спиральности».
Ради справедливости следует отметить, что к открытию структуры ДНК имела прямое отношение Розалинда Франклин, которая в лаборатории М. Уилкинса сделала прекрасные рентгенограммы РНК, которые были переданы Д. Уотсону и Ф. Крику.
Указанное открытие инициировало целый ряд исследований в области наук о жизни. Начиная с момента открытия, а особенно после расшифровки генома человека научные изыскания дают значительные практические результаты, наиболее перспективные из которых следующие: создание организмов-продуцентов биологически активных веществ; разработка генетических вакцин; развитие генной терапии; применение трансгенных растений и животных для интенсификации сельского хозяйства.
1. Литературный обзор
1.1 Генетические механизмы наследственности
1.1.1 Характеристика нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты - это природные высокомолекулярные органические соединения, обеспечивающие хранение и передачу наследственной информации в живых организмах.
Нуклеиновые кислоты - высокомолекулярные соединения со строго определённой линейной последовательностью мономеров. Структура ДНК и РНК - способ «записи информации», обеспечивающий формирование в организме двух информационных потоков. Один из потоков осуществляет воспроизведение информации, заключённой в молекулах ДНК. Удвоение молекул ДНК называется «репликацией». В результате этого процесса и последующего деления дочерние клетки наследуют геном родительской клетки, в котором содержится полный набор генов, или инструкции о строении РНК и всех белков организма. Второй поток информации реализуется в процессе жизнедеятельности клетки. В этом случае происходит «считывание», или транскрипция генов в форме полинуклеотидных последовательностей гпРНК и использование их в качестве матриц для синтеза соответствующих белков. В последнем случае осуществляется «перевод» (трансляция) информации, заключённой в тРНК, на «язык» аминокислот. Этот поток информации от ДНК через РНК на белок получил название «центральная догма биологии». Суть новой молекулярной биологии заключается в следующем: всё начинается с ДНК и заканчивается белком. Между ДНК и белком находится РНК, которая является переносчиком генетической информации от ДНК к белкам. Дальше генетическая информация переносится от РНК в особые частицы рибосомы, где реализуется при биосинтезе белков. Механизм характерен для всех живых организмов, за исключением некоторых РНК-содержащих вирусов.
1.1.2 Нуклеозиды и нуклеотиды
ДНК и РНК состоят из мономерных единиц - нуклеотидов, поэтому нуклеиновые кислоты называют полинуклеотидами.
Строение нуклеотидов. Каждый нуклеотид содержит 3 химически различных компонента: гетероциклическое азотистое основание, моносахарид (пентозу) и остаток фосфорной кислоты. В состав нуклеиновых кислот входят азотистые основания двух типов: пуриновые - аденин (А), гуанин (G) и пиримидиновые - цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) ~ см. рисунок 1.1.
Пентозы в нуклеотидах представлены либо рибозой (в составе РНК), либо дезоксирибозой (в составе ДНК). Чтобы отличить номера атомов в пентозах от нумерации атомов в основаниях, к цифре добавляют штрих (') – 1’, 2', 3', 4' и 5'. Пентозу соединяет с основанием N-гликозидная связь, образованная Сг атомом пентозы (рибозы или дезоксирибозы) и N1-атомом пиримидина или N9- атомом пурина.
Нуклеозиды - соединения, состоящие из остатков азотистого основания и углевода - рибозы или дезоксирибозы.
Нуклеотид - это нуклеозид, к которому присоединены молекулы фосфата - см. рисунок 1.2.
Остов нуклеиновой кислоты имеет одинаковое строение по всей длине молекулы и состоит из чередующихся групп - пентоза - фосфат - пентоза. Уникальность структуры и функциональная индивидуальность молекул ДНК и РНК определяется их первичной структурой - последовательностью азотистых оснований в полинуклеотидной цепи /4/.
1.1.3 Первичная структура ДНК
Первичная структура ДНК - порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов в полинуклеотидной цепи. Каждая фосфатная группа в полинуклеотидной цепи, за исключением фосфорного остатка на 5 '-конце молекулы, участвует в образовании двух эфирных связей с участием 3' и 5 '-углеводных атомов двух соседних дезоксирибоз, поэтому связь между мономерами обозначают 3',5' -фосфодиэфирной.
Концевые нуклеотиды ДНК различают по структуре: на 5'-конце находится фосфатная группа, а на 3'-конце цепи - свободная ОН-группа. Эти концы называют 5' и 3'-концами — см рисунок 1.3.
Линейная последовательность дезоксирибонуклеотидов в полимерной цепи ДНК обычно сокращенно записывают с помощью однобуквенного кода, например A-G-C - Т- Т- А- С- А от 5'-к З '-концу.
В каждом мономере нуклеиновой кислоты присутствует остаток фосфорной кислоты. При рН 7 фосфатная группа полностью ионизирована, поэтому in vivo нуклеиновые кислоты существуют в виде полианионов (имеют множественные отрицательный заряд). Остатки пентоз тоже проявляют гидрофильные свойства. Азотистые основания почти нерастворимы в воде, но некоторые атомы пуринового и пиримидинового циклов способны образовывать водородные связи.
1.1.4 Вторичная структура ДНК