Курсовая работа: Роль биологического азота в азотном балансе почв

Клубеньковые бактерии формируют симбиотические ассоциации с бобовыми растениями семейства Leguminosae, в котором выделяют три подсемейства – Mimosoideae, Papillonoideae и Caesalpinoideae. До 90% видов первого и второго подсемейств и 23% видов третьего способны вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями. Клубеньковые бактерии характеризуются видовой специфичностью (избирательностью) по отношению к растению – хозяину. Определенный вид бактерий обычно образует клубеньки только на одном или нескольких видах бобовых растений. Так, Rhizobium leguminosarum инфицирует горох, вику, кормовые бобы, чину и чечевицу; Rhizobium phaseoli – фасоль; Rhizobium japonicum – сою; Rhizobium lupini – люпин, сараделла; Rhizobium vigna – вигну, мак и арахис; Rhizobium cicer – нута; Rhizobium trifolli – клевер; Rhizobium meliloti – люцерна, донник, пажитник; Rhizobium simplex – эспарцета; Rhizobium lotus – лядвенец. Специфичность клубеньковых бактерий возникла в результате их длительного приспособления к одному растению или к группе их и генетической передачи этого свойства. В связи с этим различная приспособленность клубеньковых бактерий к растениям имеется и в пределах группы перекрестного заражения. Так, клубеньковые бактерии люцерны могут образовать клубеньки у донника. Но тем не менее они более приспособлены к люцерне, а бактерии донника — к доннику. В процессе инфекции корневой системы бобовых растений клубеньковыми бактериями большое значение имеет вирулентность микроорганизмов. Если специфичностью определяется спектр действия бактерий, то вирулентность клубеньковых бактерий характеризует активность их действия в пределах данного спектра. Под вирулентностью подразумевается способность клубеньковых бактерий проникать в ткань корня, размножаться там и вызывать образование клубеньков.

Взаимодействие бактерий с растением – хозяином.

Внедрение клубеньковых бактерий в корень бобового растения-хозяина может осуществляться двумя путями: через верхушку корневого волоска или около его конца. Первый признак инфицирования растения – своеобразное изменение формы корневых волосков, которые изгибаются в виде ручки зонтика. Степень искривления волоска зависит от вида бобового растения, активности заражающего штамма, а также места проникновения бактерий. Следует также отметить, что в отдельных случаях инфицированию подвергаются неискривленные корневые волоски. Наблюдения показывают, что у люцерны и гороха искривляются и закручиваются 60—70% корневых волосков, а у клевера — около 50%. У некоторых видов клевера эта реакция отмечается не более чем у 1/4 части заражаемых волосков. В реакции искривления, очевидно, имеет большое значение состояние корневого волоска. Растущие корневые волоски наиболее чувствительны к действию веществ, вырабатываемых бактериями. Проникнув в корень клубеньковые бактерии далее перемещаются в ткани корня растения. Наиболее легко бактерии проходят через межклеточные пространства. Внедриться в ткань корня может или одиночная клетка, или группа клеток бактерий. Если внедрилась отдельная клетка, она и в дальнейшем может перемещаться по ткани как одиночка. Путь инфицирования корня одиночными клетками свойствен растениям люпина. Однако в большинстве случаев внедрившаяся клетка, активно размножаясь, образует так называемые инфекционные нити и уже в виде таких нитей перемещается в ткани растения. Последняя представляет собой гифообразную слизистую массу, в которую погружены размножающиеся клетки клубеньковых бактерий. Нить передвигается к основанию волоска и клеткам эпидермиса. После внедрения в растительные клетки инфекционная нить покрывается целлюлозной оболочкой, которая формируется из целлюлозной оболочки клетки, вероятно, для изоляции клубеньковых бактерий. Клубеньковые бактерии могут размножаться только в тетраплоидных клетках коры и частично эпидермиса корня. Когда на пути инфекционной нити встречаются тетраплоидные клетки, часть бактерий переходит из нити в цитоплазму и начинает там размножаться.

Рис.4 Схема возникновения инфекционных нитей. В неискривленном корневом волоске видны две инфекционные нити, в искривленном — одна разветвляющаяся (по Ф. Бибердорфу).

Усиленное размножение инфицированных клеток и находящихся под их стимулирующим влиянием (при участии ростового вещества) соседних незараженных клеток приводит к формированию ткани клубенька. Обычно инфекция распространяется через тетраплоидные клетки, а кора и проводящие сосуды клубенька образуются из диплоидных клеток. Процент инфицированных корневых волосков в общем количестве деформированных необъяснимо низок. Он обычно колеблется от 0,6 до 3,2, изредка достигая 8,0. Доля удачных инфекций еще ниже, поскольку среди инфекционных нитей имеется много (до 80%) так называемых абортивных нитей, прекративших свое развитие. Скорость продвижения нормально развивающихся инфекционных нитей в растении — 5—8 мкм в час. При такой скорости путь через корневой волосок длиной 100—200 мкм инфекционная нить может пройти в течение одних суток.

Бактероиды.

Клетки клубеньковых бактерий, перешедшие в цитоплазму растительных клеток, растут, делятся, а затем трансформируются в своеобразные образования – бактероиды. Этим заканчивается процесс инфицирования – приблизительно через три-четыре недели после заражения. Бактероиды в 3 – 5 раз больше по размерам, чем обычные клетки, причем их форма меняется в зависимости от вида бобового растения от шаровидной и грушевидной до вильчатой и ветвистой. Бактероиды не делятся, они составляют до 50% массы клубенька. Бактероиды клубеньковых бактерий представляют особый интерес в связи с тем, что они являются чуть ли не единственными обитателями клубеньков бобовых растений в период интенсивного связывания ими атмосферного азота. Отдельные исследователи считают бактероиды патологическими дегенеративными формами и не связывают процесс азотфиксации с бактероидной формой клубеньковых бактерий. Большинство исследователей находят, что бактероиды являются самыми жизнеспособными и активными формами клубеньковых бактерий и что фиксация азота атмосферы бобовыми растениями осуществляется только при их участии.

Клубеньковые бактерии в клетках растения располагаются в вакуолях, окруженных перибактероидной мембраной – производным плазмалеммы растительной клетки. Бактероиды содержат больше поли-β-гидроксимасляной кислоты, гликогена и полифосфатов, чем обычные клетки клубеньковых бактерий, но меньше ДНК. Фактически бактероиды становятся своего рода азотфиксирующими органеллами клеток бобового растения-хозяина. Поэтому их называют азотосомами. В зависимости от вида бобовых культур связь клубенька осуществляется посредством одного или нескольких сосудистых пучков. Например, у гороха в основании клубенька имеется два дифференцированных сосудистых узла. Каждый из них обычно дважды дихотомически разветвляется, и в результате сквозь клубенек от места второго дихотомического разветвления проходит 8 пучков. Многие растения имеют лишь один пучок, в то же время у одного клубенька Sesbania grandiflora в возрасте одного года их удалось насчитать до 126. Довольно часто сосудистая система клубенька отделяется с внешней стороны от его коры слоем частично или полностью опробковевших клеток, получивших название клубеньковой эндодермы, соединенных с эндодермой корня. Клубеньковая эндодерма представляет собой внешний слой неинфицированной коровой паренхимы, расположенной между клубеньковой тканью и корневой корой. Все стадии развития клубеньковых бактерий, по данным чешского микробиолога В. Каша (1928), можно проследить на срезах клубеньков. Так, в верхней части клубенька, например, люцерны содержатся в основном мелкие делящиеся палочковидные клетки, в небольшом количестве молодые бактероиды, число которых возрастает постепенно по мере развития клубенька. В средней, окрашенной в розовый цвет части клубенька обнаруживаются преимущественно бактероидные клетки и реже мелкие палочковидные. В основании клубенька на ранних стадиях вегетации растения-хозяина бактероиды такие же, как и в средней его части, а к концу вегетации более раздутые и раньше дегенерирующие. Сроки появления первых видимых клубеньков на корнях различных видов бобовых растений различны (М. В. Федоров, 1952). Появление их у большинства бобовых культур чаще всего происходит во время развития первых настоящих листьев. Так, образование первых клубеньков люцерны посевной наблюдается между 4-м и 5-м днями после прорастания, а на 7 — 8-й день этот процесс происходит у всех растений. Клубеньки у люцерны серповидной появляются через 10 дней. В период функционирования клубеньки обычно плотные. Клубеньки, образованные активными культурами бактерий, в молодом возрасте имеют беловатую окраску. К моменту проявления оптимальной активности они становятся розовыми. Клубеньки, возникшие при инфекции неактивными культурами бактерий, зеленоватого тона. Нередко их структура практически не отличается от структуры клубеньков, образованных при участии активных штаммов клубеньковых бактерий, но они преждевременно разрушаются. Розовая окраска определяется наличием в клубеньках пигмента, по химическому составу близкого гемоглобину крови. В связи с этим пигмент называется леггемоглобином. Леггемоглобин содержится лишь в тех клетках клубеньков, в которых имеются бактероиды. Он локализован в пространстве между бактероидами и окружающей их мембраной. Количество его колеблется от 1 до 3 мг на 1 г клубенька, в зависимости от вида бобового растения. У однолетних бобовых растений к концу вегетационного периода, когда заканчивается процесс азотфиксации, красный пигмент переходит в зеленый. Изменение цвета начинается у основания клубенька, позднее зеленеет его вершина. У многолетних бобовых растений позеленения клубеньков не происходит или оно наблюдается только у основания клубенька. У разных видов бобовых растений переход красного пигмента в зеленый происходит с разной степенью интенсивности и разной скоростью. Клубеньки однолетних растений функционируют сравнительно недолго. У большинства бобовых культур некроз клубенька начинается в период цветения растения-хозяина и протекает обычно в направлении от центра к периферии клубенька. Один из первых признаков разрушения — образование слоя клеток с мощными стенками у основания клубенька. Этот слой клеток, расположенный перпендикулярно к главному сосуду корня, разъединяет его с клубеньком и задерживает обмен питательными веществами между растением-хозяином и тканями клубенька. В клетках дегенерирующей ткани клубенька появляются многочисленные вакуоли, ядра теряют способность окрашиваться, часть клеток клубеньковых бактерий лизируется, часть мигрирует в окружающую среду в виде мелких кокковидных клеток-артроспор. Процесс формирования артроспор в ткани лизирующегося клубенька показан на рисунке 6. Прекращают функционировать в этот период и инфекционные нити. Клетки хозяина утрачивают тургор и сжимаются теми соседними клетками, которым он еще свойствен.

Рис. 6 Начальный период формирования артроспор в бактероидах клевера. Увел. X 30 000.

Старые клубеньки темные, дряблые, мягкие. При надрезе из них выступает водянистая слизь. Процессу разрушения клубенька, начинающегося с опробковения клеток сосудистой системы, способствуют понижение фотосинтетической активности растения, сухость или чрезмерная влажность среды. В разрушенном, ослизненном клубеньке обнаруживаются часто простейшие, грибы, бациллы и мелкие палочковидные клубеньковые бактерии. Клубеньки многолетних растений, в отличие от клубеньков однолетних, могут функционировать в течение многих лет. Так, например, карагана имеет многолетние клубеньки, в которых процесс старения клеток идет одновременно с образованием новых. У вистерии (глицинии китайской) также функционируют многолетние клубеньки, образуя на корнях хозяина шаровидные вздутия. К концу вегетационного периода бактероидная ткань многолетних клубеньков деградирует, но весь клубенек не отмирает. На следующий год он вновь начинает функционировать.

Количество клубеньков на корнях бобовых растений всегда более или менее ограниченно. Клубеньки содержат больше азота, чем остальные части растения. Это служит доказательством того, что именно в клубеньках протекает процесс усвоения азота. Причем фиксация азота атмосферы осуществляется только в бактероидах, и около 90% связанного азота переходит из них в виде ионов аммония в цитоплазму корня бобового растения. Передача связанного азота из тканей клубенька в наземную часть растения присходит в период, когда бактероиды жизнеспособны. Определенное количество усвоенного растениями азота выделяется корнями в почву с продуктами корневых выделений, например с аминокислотами (аспарагиновой кислотой).

Условия формирования азотфиксирующей ассоциации.

Эффективность азотфиксации симбиотической ассоциации бобовое растение – клубеньковые бактерии определяется наличием у клубеньковых бактерий целого комплекса симбиотических признаков:

вирулентности – способности клубеньковых бактерий входить в контакт с корневой системой бобовых растений, проникать в ткани корня, размножаться в них и индуцировать образование клубеньков;

азотфиксирующей активности – способности связывать молекулярный азот атмосферы при помощи специальной ферментативной системы и превращать его в ионы аммония;

конкурентоспособности – способности внесенного в почву определенного штамма клубеньковых бактерий образовывать клубеньки в присутствии других штаммов того же вида;

специфичности – способности вступать в эффективный симбиоз со строго определенным набором сортов и видов бобовых растений.

Формирование симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями обеспечивается согласованным взаимодействием геномов растений и бактерий. Процесс возникновения и функционирования симбиотического сообщества сопровождается изменением экспрессии некоторых растительных и бактериальных генов. Ряд растительных генов, необходимых для возникновения симбиоза и осуществления азотфиксации, определены в генетических экспериментах. Обычно почвы содержат в достаточно большом количестве клубеньковые бактерии тех видов бобовых растений, которых много в составе дикой флоры данной местности или которые длительное время там культивируются. Если в данной местности не произрастает определенный вид бобовых или родственные ему по инокуляционной способности виды, то и свойственные им клубеньковые бактерии в почвах отсутствуют. Поэтому для обеспечения эффективного симбиоза семена бобовых перед посевом заражают высокоактивными штаммами клубеньковых бактерий, специфичных для данного растения.

Огромный опыт, накопившийся к настоящему времени, свидетельствует о большой роли бобовых растений в плодородии почв. Прянишников указывает, что после введения в Европе севооборотов с посевом клевера средняя урожайность зерновых повысилась с 7 до 17 т на 1 га. В Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева урожаи ржи в шестипольном севообороте с клевером однолетнего пользования на протяжении 50 лет без внесения минеральных удобрений сохраняются на уровне 14 т на 1 га, а без клевера урожай достигает лишь 7 т. На более плодородных почвах при хорошей агротехнической обработке бобовые растения повышают урожайность еще больше.

4. Методы исследования биологической азотфиксации

1. Метод расчета по коэффициентам

Коэффициент азотфиксации (Кф) Хопкинса-Питерса получил широкое распространение, им часто пользуются для определения величины связывания атмосферного азота бобовыми. Умножив общее содержание азота в растениях на Кф, получают возможный размер азотфиксации. Однако к использованию этого коэффициента надо подходить с большой осторожностью, имея в виду, что он был получен при низких урожаях. В реальных условиях, как справедливо отметил А.В.Соколов (1957), использование азота воздуха может составлять как больше, так и меньше двух третей общего азота бобовых. При известковании кислых почв, внесении фосфора и калия бобовые способны взять из воздуха более 2/3 усвоенного ими азота. Иные результаты могут быть при несоблюдении этих условий, слабом заражении клубеньковыми бактериями или без учета других факторов. Поэтому негативно следует рассматривать расчеты некоторых авторов, сделанные по результатам длительных (севооборотных) опытов, когда количество фиксированного из атмосферы а?