Курсовая работа: Содержание ДНК в нервных клетках
Важно отметить, что определение нуклеотидной последовательности клонированных мозгоспецифических мРНК позволяет воспроизвести аминокислотную последовательность кодируемого белка.
Такой анализ был осуществлен Сатклиффом, например, для одного из клонов, кодирующих РНК III класса. Этот клон гибридизуется с моз-госпецифической мРНК, присутствующей в разных отделах мозга крысы, но в разном количестве. Кодируемый этой РНК полипептид не содержит участков гомологии с ранее изученными белками.
С помощью антител к синтетическим фрагментам этого полипептида изучена его локализация в мозге. Он обнаружен в аксонах, иннервирующих клетки Пуркинье в мозжечке, пирамидные нейроны поля САЗ гиппокампа; в радиальных волокнах глубоких слоев цингулярной и соматосенсорной коры; в группах волокон свода, стриатума, латерального обонятельного тракта и других структур. Источником этих волокон являются нейроны медиального ядра трапециевидного тела, центральной покрышки моста, вентромедиального и базальноаркуатного ядер гипоталамуса, а также нейроны, разбросанные по другим структурам.
Эту работу Сатклиффа и соавторов можно считать образцом технически выполнимой и универсальной методологии поиска новых мозгоспецифических мРНК и исследования первичной структуры, мест синтеза и функциональной роли кодируемых ими мозгоспецифических белков.
Особый интерес в этом отношении представляют мРНК III и IV классов, имеющие ограниченную локализацию внутри мозга и его отдельных структур. Судя по содержанию наиболее редких мозгоспецифических мРНК, они должны транскрибироваться в ограниченных популяциях нервных клеток и, возможно, связаны с узкой функциональной специализацией этих популяций.
Для избирательного клонирования таких РНК в последние годы используют процедуру "вычитания", суть которой заключается в удалении из суммарных препаратов кДНК последовательностей, общих для разных отделов мозга, и последующем клонировании такого "вычтенного" препарата кДНК. Так, уже клонированы мРНК, имеющие ограниченное распространение в неокортексе обезьян, но их изучение еще только начинается.
В лаборатории J.С. Venter начато составление всеобъемлющего каталога генов, экспрессирующихся в мозге человека. Для этого авторы, осуществляют крупномасштабное сиквенирование клонов из библиотек кДНК мозга человека и его частей. К настоящему времени они получили частичные последовательности для примерно 3000 клонов, большинство из которых являются ранее не известными. Ближайшей задачей является картирование соответствующих генов в хромосомах человека и использование полученных данных для идентификации генов, ответственных за различные наследственные заболевания.
6. Характеристическая последовательность нуклеотидов в РНК мозга
Несколько мозгоспецифических клонов из коллекции Сатк-лиффа и соавторов проявляли необычный характер гибридизации с препаратами поли+РНК, узнавая в них общую короткую мозгоспецифическую РНК. Эта малая РНК найдена во всех отделах мозга крыс, хотя и в неодинаковых количествах. Анализ нуклеотидной последовательности нескольких клонов показал, что единственным общим для них элементом является консервативная 82-нуклеотидная последовательность, которая и ответственна за гибридизацию с ВС1 РНК. Инвариантными в этой последовательности являются 51 нуклеотид] еще 24 нуклеотида одинаковы в 90% проанализированных клонов. Справа эта последовательность соседствует с олигонуклеотидами, содержащими в основном остатки аденина. Остальные примыкающие или близкие к ней последовательности в разных клонах совершенно различны. Присутствие одной и той же или сходной нуклеотидной последовательности в разных мозгоспецифических РНК как бы маркирует их, что и послужило основанием для ее обозначения как характеристической seguence"). Эта последовательность присутствует в некодирующих областях многих генов и соответствующих пре-мРНК и в большинстве случаев удаляется при процессинге последних. Ее функция до сих пор неизвестна, хотя есть основания полагать, что она служит неспецифическим стимулятором транскрипции содержащих ее генов. В любом случае ID-последовательность не является нейроспецифическим регулятором транскрипции, поскольку она присутствует и в многих пре-мРНК соматических тканей.
В препаратах цитоплазматической РНК мозга также обнаружены короткие молекулы РНК, содержащие ID-последовательность: ВС1, ВС2 и ТЗ. Синтез этих малых РНК осуществляется РНК-полимеразой III, узнающей консервативные участки в ID-последовательности, гомологичные внутреннему промотору генов РНК-полимеразы III. Обнаруженные в клетках эукариот малые РНК, как показано в последние годы, играют важнейшую роль в таких процессах, как сплайсинг и З'-процессинг пре-мРНК, трансляция и трансмембранный транспорт секретируемых белков и т.п.
7. Альтернативный процессинг пре-мРНК в мозге
Альтернативный процессинг заключается в образовании различных зрелых мРНК из одного первичного транскрипта в результате соединения различных комбинаций экзонов и/или использования различных сигналов полиаденилирования. Одним из наиболее хорошо изученных случаев использования альтернативного сплайсинга для образования различных продуктов в разных клетках является система синтеза регуляторных пептидов, кодируемых геном кальцитонина. Этот ген кодирует небольшое семейство пептидов, два из которых (кальцитонин и катакальцин) преимущественно образуются в клетках щитовидной железы, а третий - в клетках нервной системы.
Исследование структуры гена кальцитонина и зрелых мРНК, кодирующих эти пептиды у крысы и человека, показало, что I-III экзоны являются общими для этих мРНК. IV экзон, кодирующий кальцитонин и катакальцин, присутствует только в мРНК кальцитонина и содержит специфический для нее сигнал полиаденилирования, а V и VI экзоны, содержащие CGRP-кодирующую и 3'-некодирующую последовательности, включая специфический для CGRP-мРНК сигнал полиаденилирования, присутствуют только в CGRP-мРНК. Механизмы выбора различных путей сплайсинга первичного транскрипта CT/CGRP-гена в клетках щитовидной железы и нейрона пока еще остаются неясными и сейчас интенсивно изучаются.
Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов обеспечивает также разнообразие белков миелина в ЦНС млекопитающих. В частности, показано, что различные основные белки миелина у мыши кодируются одним геном shi-локуса: при этом белок 21,5 кД кодируется мРНК, содержащей последовательность всех 7 экзонов гена, белок 18,5 кД - всех, кроме II экзона, белок 17 кД - всех, кроме VI экзона, а белок 14 кД - всех, кроме II и VI экзонов. При этом образующиеся белки идентичны по аминокислотным последовательностям, кодируемым общими экзонами.
Еще одним примером служит так называемый РРТ ген крысы, который кодирует препротахикинины а - и р-типов - предшественники целого семейства нейропептидов - тахикининов. Первый из них содержит последовательность вещества Р, а второй - вещества Р и вещества К. Анализ первичной структуры показал, что эти РНК образуются в результате альтернативного сплайсинга по экзонам, кодирующим вещество К.
Разнообразие потенциал-зависимых и лиганд-зависимых ионных каналов в мембранах нервных клеток обеспечивается существованием кодирующих такие каналы мультигенных семейств и опять-таки альтернативным сплайсингом - Один и тот же ген у дрозофилы кодирует четыре полипептидные цепи, участвующие в формировании функционально активного К-канала. Эти полипептиды имеют одинаковые центральные домены, содержащие характерные для потенциал-зависимых каналов элементы.
Как и в описанных выше системах, разные полипептидные цепи К-канала возникают в результате альтернативного сплайсинга одного первичного транскрипта. Для формирования функционально активного К-канала необходима ассоциация четырех одинаковых или разных полипептидов: очевидно, что комбинирование различных полипептидов может обеспечить широкое разнообразие различающихся по физиологически значимым параметрам каналов.
Еще один яркий пример использования альтернативного сплайсинга - образование семейства синаптических рецепторов глутаминовой кислоты. Каждый из четырех рецепторов этого семейства существует в двух вариантах, различающихся лишь коротким сегментом, предшествующим четвертому трансмембранному домену. Согласно существующей топологической модели рецептора этот сегмент имеет цитоплазматическую локализацию. В генах каждого из рецепторов альтернативные варианты 38-ами-нокислотного сегмента кодируются двумя соседними экзонами, а сами варианты рецепторов образуются в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК по этим экзонам. Добавим, что существование альтернативных вариантов для каждого из рецепторов функционально значимо: они имеют различные фармакологические и кинетические свойства и по-разному распределены в отделах ЦНС.
Наконец, роль альтернативного сплайсинга показана при образовании четырех форм тирозингидроксилазы у человека, трех форм ацетилхолинэстеразы в электрическом органе ската, трех форм периферию у мыши, полипептидов у аплизии, специфических для нейрона R15, и в ряде других случаев.
Очевидно, альтернативный сплайсинг является эволюционно древним и широко распространенным в клетках нервной системы способом увеличения качественного разнообразия синтезируемых в них полипептидов.
8. Экспрессия генома и онтогенез мозга животных
Выше уже отмечено, что общее число транскрибируемых в мозге генов в 1,5-2 раза выше, чем во всех остальных тканях, и составляет, по-видимому, несколько десятков тысяч. Многообразие экспрессируемых в целом мозге генов объясняется двумя причинами:
1) разнообразием таковых в каждом индивидуальном нейроне и 2) различиям?