Курсовая работа: Виробництво бензилпеніциліну
а) забезпечувати максимальний вихід антибіотика;
б) складатися з відносно дешевих компонентів;
в) мати гарну фільтруючу здатність;
г) забезпечувати застосування найбільш економічних прийомів виділення й очищення антибіотиків.
Стерилізація поживних середовищ у промислових умовах здійснюється двома методами: періодичним і безперервним.
Періодичний метод стерилізації застосовується у разі використання невеликих об'ємів середовища й полягає в тому, що середовище нагрівається до температури 120 – 130 °С безпосередньо у ферментерах або в спеціальних казанах-стерилізаторах, витримується при цій температурі протягом 30 – 60 хвилин (залежно від об'єму середовища і його складу), після чого охолоджується до 27 – 30 °С.
За час, затрачуваний на нагрівання середовища до температури, необхідної для стерилізації, і її охолодження, знищується значне число мікроорганізмів. Ефект стерилізації й збереження термолабільних речовин досягаються в тому випадку, якщо стерилізацію проводять за більш високої температури і за коротший проміжок час. Безперервний метод стерилізації доцільно застосовувати при використанні більших об'ємів середовища. Приготовлене середовище зі спеціальної посудини за допомогою насоса подається в стерилізаційну колону, через яку пропускають гостру пару (тиск пари близько 505 Па). Пару подають зверху по внутрішній трубі, що має щілиноподібні прорізи, завдяки чому він надходить у середовище, швидко її нагріваючи. Середовище в колону подається знизу й рухається по спіралі навколо внутрішньої труби.
Середовище, нагріте в колоні до необхідної для стерилізації температури (~130 °С), надходить у спеціальний апарат, де воно витримується певний час при температурі 125 – 130 °С. Час витримки залежить від складу середовища й триває 5 – 10 хвилин. Звідси стерильне середовище надходить у змієвиковий холодильник, охолоджується до 30 – 35 °С (на виході) і надходить у ферментер.
Безперервний метод стерилізації має ряд переваг: можливість автоматичного регулювання процесу, швидке й рівномірне нагрівання середовища, забезпечення більш повної стерильності середовища й ін.
У процесі підготовки поживного середовища для отримання бензилпеніциліну приготовлене середовище піддають стерилізації. Процес ведуть у колонах безперервної дії. Далі середовище надходить у витримувач, де охолоджується протягом певного часу до температури 23 – 25 °С [2].
3.6 Особливості перебігу процесу ферментації
У сучасних умовах найбільш перспективним методом вирощування мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків визнаний метод глибинного культивування. Метод полягає в тому, що мікроорганізми розвиваються в товщі рідкого поживного середовища, через яке безупинно подається стерильне повітря, і за постійного перемішування.
Існує чотири основні модифікації глибинного способу вирощування мікроорганізмів:
1. Періодичне культивування. У цьому способі весь процес розвитку мікроорганізмів повністю завершується в одному ферментері, після чого ферментер звільняється від культуральної рідини, ретельно промивається, стерилізується й знову заповнюється свіжим поживним середовищем. Середовище засівається продуцентом, і процес відновляється.
2. Метод відбору. Культивування мікроорганізмів здійснюється у ферментерах з періодичним відбором частини об'єму культуральної рідини і доведенням свіжим поживним середовищем до попереднього рівня.
3. Батарейний спосіб. Мікроорганізми розвиваються в ряду послідовно з'єднаних ферментерів. Культуральна рідина на певній стадії розвитку мікроорганізму перекачується з першого ферментера в другий, потім із другого в третій і т.д. Звільнений ферментер відразу заповнюється свіжим поживним середовищем, засіяним продуцентом. У цьому способі вирощування мікроорганізмів місткості використовуються більш раціонально.
4. Безперервне культивування. В основі методу лежить принцип безперервного потоку поживного середовища, що дозволяє підтримувати розвиток мікроорганізму на певній стадії його росту. Стадія розвитку мікроорганізму визначається тим, що в цей період відбувається максимальний біосинтез антибіотика або іншої біологічно активної сполуки. Встановлено, що в умовах безперервного процесу біосинтезу деяких антибіотиків можна одержати чудові результати, якщо процес вести у дві стадії. У першому апараті батареї підтримують високу швидкість потоку, що забезпечує більшу швидкість росту продуцента антибіотика, для того, щоб одержати високоактивну біомасу, а в другому апараті – забезпечують низьку швидкість потоку й відповідно невелику швидкість росту. Процес безперервного культивування – перспективний напрямок сучасної біотехнології.
Розвиток мікроорганізму у ферментерах проходить за суворого контролю всіх його стадій і точного виконанням регламенту умов розвитку. Велику увагу приділяють підтримці заданої температури культивування, активної кислотності середовища (рН), ступеня аерації й швидкості роботи мішалки. У процесі розвитку організму здійснюють біологічний контроль, враховують споживання організмом основних компонентів субстрату (джерела вуглецю, азоту, фосфору), уважно стежать за утворенням антибіотика. Проводити біологічний контроль на досить високому рівні дозволяє використання сучасного комп’ютерного забезпечення та автоматизованих систем управління.
Велике значення для утворення пеніциліну має аерація культури. Максимальне накопичення пеніциліну відбувається за інтенсивності аерації, що дорівнює 1 од. об’єму повітря за 1 хв. на 1 од. об’єму середовища. Зменшення інтенсивності аерації або надмірне збільшення призводять до зниження біосинтезу пеніциліну. Важливу роль при цьому відіграє перемішування культури. Так, із збільшенням потужності, що витрачається на обертання мішалки у ферментері об’ємом 7500 л, швидкість споживання лактози збільшується і біосинтез антибіотика зростає (рис. 4). Від способу перемішування культуральної рідини залежить форма і величина глибинних колоній, стан яких визначає міру здатності міцелію до синтезу пеніциліну [6].
Рис. 4. Графік залежності накопичення пеніциліну від інтенсивності перемішування.
Велику увага в процесі розвитку продуцента у ферментерах звертають на процес піногасіння. Під час продування повітря через культуру мікроорганізму утворюється піна, яка суттєво порушує процес розвитку продуцента антибіотика у ферментері. Поява великої кількості піни обумовлена білковими речовинами, що знаходяться у середовищі, і її високою в'язкістю, що пов'язано з інтенсивним накопиченням біомаси.
Для боротьби з піною у ферментерах використовують поверхнево активні речовини: рослинні олії (соєву, соняшникову), тваринний жир (лярд, китовий жир), а іноді мінеральні олії (вазелінову, парафінову), спирти й вищі жирні кислоти. Нерідко в якості піногасників використовують спеціально синтезовані речовини (силікони, диазобутананкарбаміл та ін.).
Багато речовин (олії, жири, спирти й ін.), використовувані в якості піногасників, споживаються продуцентами антибіотиків як додаткові джерела вуглецевого живлення. При цьому часто спостерігається підвищення виходу антибіотика. Однак внесення піногасника може знижувати швидкість розчинення кисню, що, у свою чергу, негативно позначається на розвитку мікроорганізму і його біосинтетичну активність.
Іноді використовуються механічні способи піногасіння (відсмоктування піни через спеціальні труби, руйнування пухирців піни сильними струменями рідини, пари або газу).
Загальна схема виробництва антибіотиків до стадії виділення й хімічного очищення представлена на рис. 5.
Рис. 5. Схема виробництва антибіотиків: I – приготування посівного матеріалу; II – інокулятори для нарощування посівного матеріалу; III – стерилізатор середовища для великого ферментера; IV – установка для біосинтезу антибіотика; а – стерилізація середовища в колбах; б – охолодження й посів культури продуцента в колбу; в – ріст культури в стані спокою; г – ріст культури в качалці; д – інокулятор зі стерильним середовищем; е – інокулятор із середовищем, засіяним культурою продуцента; є – ферментер;
Перша стадія процесу – вирощування стандартної колонії штамів плісняви Penicillium chrysogenum – проводиться в інокуляторах на поживному середовищі де процес іде ~30 годин. Підготовлений інокулят переносять у посівний апарат, об'єм якого ~ в 10 раз більше об'єму інокулятора. У посівному апараті знаходиться також стерилізоване поживне середовище. Процес росту тут іде ~15 – 20 годин, і далі посівний матеріал подається на ферментацію в більші реактори – ферментери об'ємом до 100 м3 . Процес ферментації триває ~70 годин за температури 23 – 24 °С, рН середовища 6 – 6,5 і за інтенсивної аерації (1 од. об’єму повітря за 1 хв на 1 од. об’єму середовища) [2].