Курсовая работа: Вірусний гипатит С
Спеціальні коефіцієнти дозволяють перераховувати отримані показники концентрації в міжнародні одиниці.
Для визначення концентрації РНК ВГС застосовують практично усі варіанти ПЛР. При цьому до діагностичних препаратів пред'являється ряд специфічних вимог, найважливішим з який є лінійність результатів, тобто збільшення сигналу реєстрованої реакції при збільшенні концентрації РНК ВГС у досліджуваному зразку. Застосування внутрішніх стандартів з різним вмістом РНК ВГС дозволяє уникнути багатьох методичних помилок, що можуть відбитися на кінцевому результаті реакції.
ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ ("Real-tіme RT PCR") - один з найбільш перспективних варіантів кількісного методу виявлення РНК ВГС. Принцип методу полягає в здатності гідролізувати послідовності кДНК у напрямку 5'-і-і 3'. У реакції застосовується спеціальний зонд, мічений двома флуоресцентними барвниками, що мають близькі максимуми поглинання і флюоресценції. При наявності продуктів ампліфікації Tag-полімераза розщеплює зонд, що приводить до запобігання переносу енергії від однієї молекули барвника до інший, і тим самим запобігає вихіду кванта світла. Спеціальний прилад здійснює облік реакції і математичне моделювання кінетики флюоресценції на кожнім етапі реакції, що дозволяє одержати інформацію про вихідну концентрацію РНК ВГС.
Відмінною рисою "ПЛР у реальному часі" вважають можливість одержувати інформацію про наявність РНК ВГС безпосередньо в процесі реакції, що дозволяє зменшити час аналізу в сполученні з високою чутливістю і лінійністю одержуваних результатів. [Bukh, 2000].
МЕТОДИ ГЕНОТИПУВАННЯ РНК ВГС. Визначення приналежності ВГС до визначеного генотипу і субтипу знайшло своє застосування для рішення не тільки чисто наукових, але й практичних питань. Наприклад: пошук джерела інфекції під час спалахів гепатиту С чи прогнозування ефективності застосовуваної терапії.
"Золотий стандарт" генотипування ВГС - безпосереднє визначення первинної структури РНК ВГС із його наступним філіпченковим аналізом, що дозволяє чітко охарактеризувати даний ізолят вірусу [Kondo, 1993].
Незважаючи на точність одержуваного результату, метод безпосереднього секвенирування не використовується в практичній охороні здоров'я через технічні складності проведення дослідження і високої вартості робіт. Разом з тим наявність інформації про первинну структуру РНК ВГС є референтним методом генотипування, а наявність приладів для автоматичного секвенирування спрощує одержання результату. В даний час у більшості випадків для генотипування РНК ВГС застосовуються методи, засновані на використанні ПЛР із типоспецифічними праймерами. Гібридизація ампліфікованих продуктів із адсорбованими геноспецифічними зондами (з 5'-нетрансльованої зони РНК ВГС), адсорбованими на нітроцелюлозній мембрані.
Методичний арсенал визначення генотипів ВГС не обмежується перерахованими вище способами і містить у собі різноманітні методи:
генотипування на основі аналізу профілів рестрикції ампліфікованих продуктів. Продукти ампліфікації фрагментів РНК ВГС (NS5 область РНК ВГС) розщеплюються рестриктазами. Фрагменти, що утворилися, розрізняються по довжині в залежності від наявних усередині них сайтів рестрикції, по яких йде розщеплення. Результати електрофорезу і їхнє порівняння дозволяють ідентифікувати генотип ВГС у досліджуваному зразку. Порівняння результатів генотипування з даними секвенирування продемонструвало високий рівень збігу результатів - 95% [Ильина, 2000].
Генотипування на основі методу оцінки конформаційного поліморфізму одноланцюгових фрагментів ДНК. Як об'єкт дослідження обраний 5'-нетрансльований регіон РНК ВГС, що має мінімальний набір нуклеотидних варіацій, що відрізняють генотипи друг від друга. Цей факт визначає можливість застосувати загальні праймери при генотипуванні.
СЕРОТИПУВАННЯ Анти-ВГС стало можливим завдяки дослідженням P. Sіmmonds зі співавторами, який встановив наявність антитіл, спрямованих до генотипспецифічних епітопів, інформація про які кодована NS4 зоною РНК ВГС.
Серотипування анти- ВГС у порівнянні з генотипуванням РНК ВГС має такі переваги, як простота проведення реакції і більш низька вартість. Разом з тим, цей метод ні в якому разі не може замінити генотипування. Результати серотипування анти-ВГС свідчать про типову приналежність анти-ВГС при поточній чи раніше перенесеній інфекції. У деяких випадках (найбільше часто в хворих гемофілією) реєструється одночасне виявлення анти-ВГС різних підтипів, що може свідчити про множинне інфікування різними субтипами і генотипами ВГС. Крім того, у пацієнтів з гепатитом С на фоні вираженого імунодефіцитного стану РНК можуть бути єдиним маркером, що унеможливлює проведення серотипування [Мукомолов, 1999].
1.6 Лікування
До недавніх часів кращим засобом проти ВГС вважався інтерферон, ці ліки, що інгибують реплікацію вірусу. Медикаментозний інтерферон, що використовується для лікування гепатитів включає: ІNFγ-2b (інтрон-а), ІNFγ-2a (роферон-а) і ІNF alfacon-1 (інферген). Але інтерферони працюють тільки в 20% випадків [Саринсон, 1998]. Зараз ін'єкції інтерферону комбінують з пероральним введенням рибавірина (Виразол) - антивірусний агент широкого спектра дії. Лікування звичайно триває від 6 міс. до року, і є успішним приблизно лише для 40% хворих [Goodson, 1992].
Недавні дослідження показали, що інші ліки, пролонгований інтерферон, є в 2 рази більш ефективним, ніж звичайний інтерферон. У січні 2001 року Харчове і Лікарське Керування запропонували використання пролонгованого інтерферону - γ-2В - для лікування гепатиту С [Hoofnagle, 2001].
Відомо, що функції інтерферону (ІFN) в організмі різноманітні, однак найбільш важливої з них є антивірусна, яка здійснюється шляхом стимуляції вироблення антивірусних білків у інтактних клітинах, що забезпечує в них розвиток т. н. антивірусного стану [Григорян, 1990]. Унікальні властивості ІFN з'явилися причиною активної розробки різних технологій його виробництва і клінічного застосування. Незважаючи на успіхи ІFN-терапии і розширення спектра його застосування, існує багато проблем, зв'язаних з цим видом лікування. Частота порушень ІFN статусу, розширення представлень про спектр захворювань, при яких необхідна терапія препаратами ІFN, висока вартість, можливість виникнення ряду ускладнень від їхнього застосування, стимулювали дослідження з вивчення індукторів ІFN.
Побічний ефект від застосування лікарської терапії інтерфероном містить у собі симптоми, схожі з грипом і тимчасове зниження вмісту гемоглобіну в крові (анемія), лейкоцитів і тромбоцитів у крові. Хронічні побічні ефекти - які складають приблизно половину при прийнятому лікуванні інтерфероном-рибавірином - включають сильну втому, занепокоєння, дратівливість і депресію. Невеликий відсоток людей випробує психологічні чи суїцидальні настрої. Вчені розробляють використання інгібіторів протеаз для лікування людей із ВГС. Ці ж медикаменти використовуються для деяких людей, хворих СНІДом. У майбутньому можливе лікування ВГС за допомогою генної терапії. Найкраще лікування для людей на кінцевій стадії печінкової хвороби (печінкова недостатність) є пересадження печінки [Подимова, 1998].
Встановлено, що в ряді випадків застосування індукторів ІFN має переваги перед використанням екзогенних ІFN. Так, індуктори ІFN стимулюють вироблення власних ІFN, що не володіють антигенностью. При цьому їхній синтез знаходиться під контролем ІЛ і білків-репресорів і не досягає рівня, здатного зробити дію, що ушкоджує, організм. Індуктори ІFN розрізняються по хімічній природі, по тому на які клітки-продуценти вони діють, синтез якого виду ІFN вони викликають, а також за часом досягнення максимальної концентрації ІFN у сироватці і тривалості дії препарату [Григорян, 1990].
Аміксин відноситься до класу флуоренів і є низькомолекулярним індуктором ендогенного інтерферону.
Амікcин поліпшує перебіг запального процесу, активує макрофаги, збільшує кількість протизапальних цитокінів, підвищує секрецію лізосомних ферментів, інгибує ферменти, субстратом яких служить ДНК: ДНК-полімераза, топоізомераза, зворотня транскриптаза. Про здатність аміксина брати участь у моделюванні імунної системи можна судити за результатами, що свідчать про активацію NK [Григорян, 1990].
У зв'язку з недостатністю інтерфероногенеза, що спостерігається в хворих вірусними ?