Курсовая работа: Влияние гипотермии на экспрессию генов

6. Гены белков, связанных с процессом льдообразования

Установлено, что бактериальный ген, связанны с образованием льда, inaZ при перемещении в трансгенные растения вызывает образование ядер льда. Предварительная инкубация преобразованной ткани растения при температурах около 0 ⁰ C существенно повысила активность нуклеации льда в растениях, хотя максимальная активность нуклеации льда была достигнута только после низкотемпературно обработки продолжительностью около 48 часов. Хотя трансгенные растения содержат сходные количества мРНК inaZ как при «нормальных», так и при низких температурах, установлено, что низкие температуры необходимы для накопления белка INAZ. Предлагается, что устойчивость INAZ белка и, таким образом, активность нуклеации льда в трансгенных растениях усиливается при низкотемпературной обработке.

7. Гены, кодирующие белки, связанные с передачей кальциевых сигналов

Вопрос о механизме восприятия и трансформации сигнала в клетках растений к настоящему времени все еще изучен недостаточно. Установлено, что роль вторичного посредника в передаче стрессовых сигналов у различных организмов, в том числе и у растений, играют ионы Ca² +. В клетках растений, не подвергнутых действию стресса, уровень содержания Ca² + при помощи активных Ca² +-транспортирующих систем поддерживается на низком, наномолярном уровне. Холодовой шок вызывает резкое увеличение концентрации Ca²⁺ в цитоплазме. На животных клетках во время стресса были показаны активации ионами Ca²⁺ протеинкиназы С и Ca²⁺ -кальмодулинзависимо протеинкиназы, вызывающие изменения экспрессии генов. Для выяснения роли Ca² ^ процессах ответа растения на низкотемпературны стресс и адаптации к низко температуре были проведены эксперименты по изучению влияния хелатора Ca²⁺ - ЭГТА и блокаторов кальциевых каналов - La³⁺ и верапамила - на процессы адаптации растени люцерны к холоду. Результаты экспериментов показывают, что ЭГТА ингибирует низкотемпературную адаптацию на 70%, а La³⁺ и верапамил полностью блокируют развитие процесса низкотемпературно адаптации у люцерны.

Чтобы далее исследовать путь передачи сигнала, который стимулирует ответ на холодовой шок у кукурузы, был выделен кодирующий низкотемпературно-индуцируемую кальций -зависимую протеинкиназу клон кДНК. Эксперименты по изучению динамики ответа на стресс показали, что низкотемпературная индукция Zmcdpk1 предшествует аналогичному показателю для mlip15, другого холодоиндуцируемого гена, кодирующего ДНК-связывающий белок типа ле цин-зиппер, что указывает на то, что Zmcdpk1 может размещаться раньше mlip15 в пути передачи вызванного холодным стрессом сигнала. При этом было отмечено, что уровень mlip15 мРНК в конститутивном состоянии в большой степени возрос после обработки циклогексимидом. Кроме гена mlip15, циклогексимид увеличивает уровни транскрипции двух других индуцируемых низко температуро генов -Zmcdpk1 и Adh1, кодирующего алкогольдегидрогеназу 1. Напротив, экспрессия гена хальконсинтетазы индуцировалась только низко температуро. Аккумуляция транскриптов mlip15 при низких температурах и в ответ на циклогексимид значительно уменьшалась после предварительно обработки хелатором кальция, что позволяет предполагать, что кальций вовлечен в обоих случаях индукции гена mlip15.

После холодового шока усиливается экспрессия TCH-генов из Arabidopsis, которые кодируют калмодулин-связанные белки и ксилоглюкан эндотрансглюканазу. Была исследована возможная роль колебаний во внутриклеточных концентрациях иона кальция Ca²⁺ в вызванно холодовым шоком экспрессии гена TCH. Для этого у трансгенных растени, несущих ген апоэкворина, был проведен мониторинг содержания Ca²⁺ с тем, чтобы исследовать необходимость индуцируемого холодом увеличения содержания Ca²⁺ для экспрессии TCH. Индуцированное холодовым шоком увеличение содержания Ca²⁺ может быть заблокировано La³⁺ и Gd³⁺ , предполагаемыми ингибиторами Ca²⁺ -канала в плазматической мембране, и 1.2-бис этан-н,н-тетраацетиловой кислотой, внеклеточным хелатором Ca² +. В ходе экспериментов было установлено, что индуцируемая холодовымшоком экспрессия TCH генов затормаживается высокими уровнями содержания всех этих агентов, что, как было показано, блокирует увеличение содержания Ca²⁺ . Эти данные подтверждают то, что внутриклеточное увеличение содержания Ca²⁺ , следующее за холодовым шоком, требует внеклеточного Ca²⁺ и может получить необходимы приток Ca²⁺ опосредованно через Ca²⁺ каналы плазмалеммы. Во-вторых, результаты экспериментов свидетельствуют, что индуцируемая холодом экспрессия хотя бы подкласса TCH-генов требует увеличения содержания внутриклеточного Ca²⁺ .

8. Гены белков холодового шока

Установлено, что у бактерий существует многочисленное семейство генов, экспрессирующихся только в ответ на резкое снижение температуры. Гены этого семейства обозначены как гены белков холодового шока. Показано, что для начала экспрессии некоторых из этих белков холодового шока бактерий достаточно снижения температуры на 10 - 15⁰ С.

Известно, что экспрессия гена CspA, важнейшего белка холодового шока Escherichiacoli, очень сильно индуцируется во время резкого снижения температуры. Установлено, что замена трех оснований около последовательности Shine-Dalgarno размером в 159-оснований в 5'-нетранслируемой области мРНК cspA стабилизирует мРНК, приводя к конститутивному синтезу CspA при 37⁰ С. Как оказалась, эта стабилизация, по крайне мере частично, происходит из-за сопротивления деградации РНКазо E. Холодовая индукция cspA также достигалась путем замены его промотора промотором Ipp, не индуцируемым-холодовым шоком. Таким образом, полученные данные указывают на то, что ген CspA эффективно транскрибируется даже при 37⁰ C. В то же время трансляция мРНК белка CSPA заблокирована вследствие ее предельно нестабильности при 37⁰ C. Представленные результаты также демонстрируют, что ген cspA конститутивной транскрибируется при всех температурах; однако его экспрессия при 37⁰ C предотвращена из-за дестабилизации его мРНК.

С целью оценить эффективность промоторов белков холодового шока для их низкотемпературно экспрессии, было сконструировано транскрипционное слияние генов между промотором гена cspA и геном бета-галактозидазы lacZ. Показано, что в таком слитом гене синтез бета-галактозидазы эффективно подавлялся при 37⁰ C, но быстро индуцировался при переносе в 15⁰ C, приводя к трех- пятикратному увеличению в специфическо активности белка относительно контрольно бактериально культуры. Только продолжение инкубации культуры при 20⁰ C, но не при 15⁰ C, приводило к ослаблению активности из-за деления клетки и репрессии промотора, хотя исходные показатели накопления бета-галактозидазы при 20⁰ C были в два раза выше измеренных при 15⁰ C.

Из двух штаммов Lactobacillusplantarumбыли клонированы два гена белков холодового шока, cspL и cspP. Эти гены, являющиеся неаллельными, присутствовали во всех исследованных штаммах. Данные гены кодируют полипептиды из 66-аминокислотных остатков, родственные друг другу и принадлежащие к семейству CSP - «белков холодового шока». Транскрипция гена cspP оканчивается единственной мРНК, в то время как для гена cspL были найдены две cspL мРНК с общими 5' концами. Содержание этих транскриптов умеренно возрастало в ответ на обработку культур холодом.

При изучении ответа лактозно-кислых бактерий на замораживание было установлено, что при замораживании культуры лактозно-кислых бактерий жизнеспособность клеток в значительно мере снижалась. В то же время, когда культуры бактерий перед замораживанием были предварительно подвергнуты в течение 2 часов холодовому шоку при 10⁰ C, значительно улучшалась жизнеспособность у штаммов Lactococcuslactissubsp.lactis и PediococcuspentosaceusPO2, но она не менялась у штамма Lactococcuslactissubsp. cremoris и у штаммов LactobacillushelveticusLB1 и StreptococcusthermophilusTS2. Жизнеспособность клеток возросла еще более, когда период холодового шока был продлен до 5 часов. Использование дегенерированных PCR пра меров, полученных как из гена важнейшего белка холодового шока Escherichiacoli, так и Bacillussubtilisприводит к образованию PCR продуктов у всех изученных штаммов. PCR продукт из Lactococcuslactisssp. LactisM474 был клонирован и секвенирован. Вычисленная для этого белка последовательность аминокислот показала высокую гомологию с аминокислотными последовательностями других белков семе ства CSP. Использование PCR праймеров, основанных на последовательность M474, приводило к образованию PCR продуктов только у изученных штаммов лактококков, но не у изученных штаммов Lactobacillushelveticus, Streptococcusthermophilusили Pediococcuspentosaceus.

9. Гены протеинкиназ

Клон кДНК для гена рецепторо-подобно протеинкиназы был выделен из Arabidopsisthaliana. Этот клон длиной 1952 bp с открытой рамкой считывания размером 1623 bp кодирует пептид из 540 аминокислот, которы содержит четыре области, характерных для рецепторной киназы. Во-первых, он содержит характерную для киназ предполагаемую аминотерминальную сигнальную область последовательности. Во-вторых, он содержит область с пятью экстрацеллюлярными богатыми ле цином повторяющимися последовательностями. В-третьих, он имеет мембрано-связывающую область и, в-четвертых, домен цитоплазматическо протеинкиназы, который содержит все 11 субдоменов, характерных для протеинкиназ. Ген RPK1 экспрессируется в цветах, побегах, листьях и корнях. Показано, что экспрессия гена RPK1 индуцируется в течение 1 часа после обработки экзогенно абсцизовой кислотой. Ген также быстро индуцируется различными другими абиотическими стрессами, такими, как обезвоживание, высокая концентрация солей и низкая температура. Предлагается, что данный ген вовлечен в общий ответ клетки на стресс. Вызванная обезвоживанием индукция гена rpk1 не нарушается в дефицитных по эндогенно абсцизовой кислоте мутантах aba-1, abi1-1, abi2-1, abi3-1 и, вследствие этого, предполагается, что эта индукция не зависит от обработки абсцизовой кислотой.

10. Гены картофеля, индуцируемые хранением на холоду

Хранение клубне картофеля на холоду при 4 ⁰ C связано с

накоплением нескольких индуцируемых холодом транскриптов генов. Путем использования в качестве зонда ранее охарактеризованной кДНК был выделен и секвенирован соответствующий ген ci7.

Предполагаемы промотор ci7 содержит последовательность элементов, которая, как было показано, регулирует экспрессию индуцируемых холодом генов у Arabidopsisthaliana. Транскрипты CI7 дифференциальной экспрессируются в клубнях и листьях картофеля в ответ на холодовой стресс, засуху, высокую концентрацию солей или обработку экзогенно абсцизовой кислотой. В то время как накопление транскриптов CI7 во время хранения на холоду происходит в течение нескольких дне, индукция транскриптов CI7 в ответ на засуху, экзогенную абсцизовую кислоту и солевой стресс происходит быстро, в течение нескольких часов. Накопление белка CI7 в ответ на абиотические стрессы и обработку экзогенно абсцизовой кислотой в клубнях было небольшим, особенно по сравнению с уровнем содержания транскриптов. В листьях белок CI7 отсутствовал после всех исследованных воздействи. В ходе экспериментов растения S. tuberosumбыли трансформированы слитым с репортерным GUS-геном 5'-фланкирующим промоторным регионом ci7 размером 3 kb. Анализ клубне независимых трансгенных лини не обнаружил значительно индукции энзиматической активности GUS в ответ на низкотемпературное воздействие. В то же время, когда для анализа уровня индукции гена GUS с введенным ci7 промотором был использован РНК блоттинг, гетерологичное слияние GUS сильно индуцировалось в ответ на низкие температуры. По сравнению с РНК блот-анализом трансгенных растений, изучение ядерной «run-on» транскрипции ci7 гена показало, что большая часть температурно-регулируемо экспрессии гена ci7 в клубнях может быть связана с посттрансляционными механизмами контроля.

Анализ последовательности кДНК клона CI21, который соответствует другому индуцируемому холодом транскрипту, обнаруживает высокую гомологию с транскриптами томата и дикого картофеля, индуцируемыми созреванием и водным стрессом. Два гомологичных, неаллельных гена, ci21A и ci21B, были выделены и секвенированы. Нозерн-блот анализ показал, что самые высокие уровни содержания транскриптов ci21 обнаружены в хранимых в холоде клубнях. Более низкие уровни транскриптов содержатся в стеблях и корнях, и самые низкие уровни отмечены в листьях и клубнях, хранимых при комнатной температуре. Обработка растений абсцизовой кислотой, высокая концентрация соли и тепловой шок не оказывали значительного влияния на уровни содержания транскрипта ci21 в клубнях и листьях. Подсушивание было единственным стрессом, вызывавшим транскрипцию CI21 на листьях, но оно не вызывало ее в клубнях. Вестерн-блот анализ обнаружил белок CI21 только в клубнях. Химерный ген, созданный путем слияния предполагаемо области промотора ci21A и репортер-геном uidA, тестировался на индукцию бета-глюкуронидазы низко температуро в трансгенных картофельных растениях, при этом в ответ на хранение клубне при 4 ⁰ C у трансгенных растений наблюдалось двукратное увеличение активности бета-глюкуронидазы.

11. Гены Y-box белков и белков, регулирующих процессы транскрипции и трансляции

В ходе исследований экспрессии генов семейства Y-бокс белков, регулирующих процессы транскрипции в клетках, было установлено, что высококонсервативный элемент основы промо