Научная работа: Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina
Морские водоросли; поглощается из среды E. Coli, S. typhimurium
Galinski, 1995;
Welsh, 2000
Cosquer et. al., 1999; Pichereau et al., 1998
Пипиколиновая кислота
Brevibacterium ammoniagenes, Sinorhizobium meliloti
Gouesbet et al., 1992
Gouffi et al., 2000
Карнитин
Поглощаются из среды: E. coli, Lactobacillus plantarum, Listeria monocytogenes,
Pediococcus halophilus, Brevibacterium linens, Pseudomonas aeruginosa, Listeria
monocytogenes
Sleator, Hill, 2001
Kets et al., 1994
Bayles et all., 2000
Jebbar et al., 1998
Глава 2 Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина
Эктоин как осмоактивное вещество впервые обнаружен Э. Галинским у фототрофной пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halochloris (Galinski et al., 1985). По химической структуре эктоин может быть классифицирован как частично гидратированная иминокислота (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат).
Накопление эктоина показано для различных галофильных и галотолерантных Г+ и Г- эубактерий, включая виды Nocardiopsis, Brevibacterium и Marinococcus, а также Halomonas, Pseudomonas и Vibrio (табл.1). Интересно отметить, что негалофильные эубактерии накапливают эктоин, транспортируя его из среды в гиперосмотических условиях (Jebbar et al., 1992, 2005; Peter et al., 1998, Malin and Lapidot, 1996).
2.1 Гены и ферменты биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина
Путь биосинтеза эктоина, является ответвлением в пути синтеза аминокислот аспартатного семейства. В этом пути аспартат-b-полуальдегид (AПA) превращается в L-2,4-диаминобутират (ДАБ) с участием ДАБ-аминотрансферазы, ДАБ ацетилируется в Ng-ацетил-2,4-диаминобутират (АДАБ) при участии ДАБ-ацетилтрансферазы. Циклизация АДАБ в эктоин катализируется эктоинсинтазой (Peters et al., 1990). Данный путь подтверждён энзиматически для фототрофа Ectothiorhodospira halochloris (Peters et al., 1990), гетеротрофов Halomonas elongata (Canovas et al., 1998), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002) и морской бактерии Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997) (Рис. 1).
У Brevibacterium linens (Bernard et al., 1993), Brevibacterium epidermis DSM 20659 (Onraedt et al., 2004), Brevibacterium sp. (Nagata et al., 1998), Streptomyces parvulus (Inbar and Lapidot, 1988) путь биосинтеза эктоина начинается с глутамата. Кроме аспартата и глутамата, в качестве предшественника может использоваться аспарагин, как показано для Streptomyces griseus и Streptomyces clavuligerus (Malin and Lapidot, 1996).
???? ?????????? ??????? ???????????????? ? ????????????????? ???????? ??????????? ???????? Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), ????????????????? ???????? Chromohalobacter salexigens (????? Halomonas elongata DSM 3043) (Canovas et al., 1997) ? Halomonas elongata (Canovas et al., 1998) ? ??????????? ? ????? ??????? ectABC, ??? ??? ect? ???????? L-2,4-???-?????????????????, ? ???? ect? ? ect? ???????? L-2,4-???-???????????????? ? L-?????????????, ??????????????. ????? ???????, ???? ?????????? ??????? ?????????? ????????????? ? ????????? ????????? ? ??????????? ect-?????.
Рис. 1. Путь биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина у галотолерантных бактерий (по Peters et al., 1990; Galinski, 1995; Ventosa et al., 1998). EctA - ДAБ-ацетилтрансфераза, EctB - ДAБ-аминотрансфераза, EctC - эктоинсинтаза и EctD - эктоингидроксилаза.
Биосинтез гидроксиэктоина осуществляется непосредственным гидроксилированием эктоина эктоингидроксилазой (EctD). К настоящему моменту ген ectD идентифицирован у Streptomyces chrysomallus (Prabhu et al., 2004), Chromohalobacter salexigens (García-Estepa et al., 2006) и Salibacillus salexigens (Bursy et al., 2007).
Возможно, существует также альтернативный путь, в котором Ng-ацетил-ДАБ превращается в гидроксиэктоин через 3-гидрокси-Ng-ацетил-ДАБ без участия эктоина (Canovas et al., 1999). Но этот путь энзиматически не подтвержден.
Ферменты биосинтеза эктоина. Ферменты биосинтеза эктоина были очищены из H. elongata и частично охарактеризованы (Ono et al., 1999). 2,4-ДAБ-аминотрансфераза является гомогексамером с молекулярной массой субъединицы 44 кДа. ДAБ-аминотрансфераза является пиридоксальфосфат-зависимым ферментом, и требует присутствия ионов К+ для активности и стабильности, что обусловлено возможным наличием в белке специфических связывающих участков для этого иона. Зависимость от калия установлена для многих ферментов галофильных архей и эубактерий (Toney et al., 1995). ДАБ-аминотрансфераза H. elongata специфична к L-глутамату как донору аминогрупп, рНopt - 8.6-8.7, Км для L-глутамата 9.1 мМ, для D,L-аспартатполуальдегида 4.5 мМ. Изоэлектрическая точка рI = 6.2.
В настоящее время превращение аспартатполуальдегида в ДАБ известно у нескольких не синтезирующих эктоин бактерий - Xanthomonas sp. и Acinetobacter baumannii (Ikai and Yamamoto, 1997; Rao et al., 1969). ДАБ-аминотрансфераза из А. baumannii участвует в биосинтезе компонента клеточной стенки -1,3-диаминопропана. Этот фермент также специфичен к аспартатполуальдегиду как акцептору аминогрупп и L-глутамату как донору аминогрупп, обладает сходными с ферментом из H. elongata значениями рН оптимума, Км для ДАБ и 2-оксоглутарата (Ikai and Yamamoto, 1997). Однако, в отличие от ферментов из H. elongate и А. baumannii, ДАБ-аминотрансфераза из Xanthomonas sp., использует L-аланин как донор аминогрупп (Rao et al., 1969).
ДАБ-ацетилтрансфераза из H. elongata была очищена в 400 раз, однако в гомогенном состоянии фермент получить не удалось вследствие его нестабильности. Кинетические константы также не определены. Молекулярная масса фермента, определенная гель фильтрацией, составила около 45 кДа (Ono et al., 1999).
Эктоинсинтаза была очищена до гомогенного состояния в присутствии 1 мМ ДАБ и 2 М NaCl в качестве стабилизаторов. Фермент является гомодимером с молекулярной массой субъединицы 19 кДа, но в буфере с высокой осмолярностью (0.5 М NaCl), использовавшемся при гель-фильтрации, активность фермента не найдена. Поэтому неясно, действительно ли нативная эктоинсинтаза имеет молекулярную массу 35 кДа и является гомодимером, или имела место неспецифическая агрегация мономеров в присутствии высокой концентрации соли. Анализ аминокислотного состава эктоинсинтазы выявил повышенное содержание L-аспартата и L-глутамина. Фермент весьма специфичен к AДAБ, по-видимому, N-ацетильная группа в a-положении не участвует в циклизации молекулы. Изоэлектрическая точка фермента (рI) составила 4.2 - 4.4. Предполагается, что лимитирующим звеном биосинтетической последовательности эктоина является синтез ДАБ с участием ДАБ-аминотрансферазы. Это подтверждает факт отсутствия ДАБ в клетках H. elongata KS3 (Ono et al., 1998).