Научная работа: Выделение белков

Выделение практически чистого индивидуального белка (в таких случаях нередко употребляют не вполне удачный термин "гомогенный белок") — необходимая предпосылка для изучения его строения и функциональных свойств. Технические приемы, используемые для этого, весьма многообразны и быстро совершенствуются, причем наряду с развитием микрометодов все чаще возникает необходимость масштабирования процессов, с тем, чтобы получать крупные количества высокоочищенных белков для нужд медицины и биотехнологии. Особенно обострилась потребность в эффективных методах разделения белков с развитием генно-инженерных способов их получения. В данной главе рассмотрены лишь наиболее общие принципы препаративной химии белков.

Особенности выделения белков

Получение чистых химических индивидуальных белков включает в себя как удаление небелковых примесей, так и разделение между собой собственно белковых компонентов. Последняя часть задачи в силу сходства физико-химических свойств белков особенно сложна, поэтому именно ее решение определяет выбор тех или иных схем выделения белка. При этом необходимо учитывать некоторые особенности поведения, присущие всем белкам.

К ним относится, прежде всего, способность белков подвергаться денатурации, т.е. претерпевать такие изменения пространственного строения, которые приводят к утрате или частичной потере функциональных свойств. Правда, денатурация во многих случаях обратима, однако эта обратимость не обеспечивается автоматически, а требует в каждом отдельном случае подбора специальных приемов. В то же время полностью или даже частично денатурированные белки весьма уязвимы для необратимых повреждений, в особенности для действия протеолитических ферментов, поэтому условий, способствующих денатурации, следует всемерно избегать.

Для предотвращения тепловой денатурации выделение белка проводят при низкой температуре,обычно при 4 ºС. Необходимо также избегатькрайних значенийpH. Белки легко денатурируют при низких рН из-за протонирования отрицательно заряженных в нормальных условиях карбоксильных групп и возникающего вследствие этого резкого преобладания положительных зарядов, которое благоприятствует развертыванию компактной структуры. В щелочной среде при рH 10 и выше утрачиваются положительные заряды, обусловленные протонированием ε-аминогрупп лизина, и опять-таки наступает декомпенсация зарядов на поверхности, дестабилизирующая глобулу. Одновременно фенольные гидроксилы тех остатков тирозина, которые были скрыты внутри глобулы, получив отрицательный заряд, стремятся выйти на поверхность, что также способствует денатурации белка.

В еще более щелочных растворах происходят реакции, необратимо повреждающие белок, — отщепление серы от остатков цистеина и цистина, β-элиминирование фосфатных остатков в фосфопротеинах, отщепление полисахаридных цепей, присоединенных к остаткам серина в гликопротеинах. Образующиеся в результате этих реакций остатки непредельной аминокислоты — дегидроаланина— присоединяются кблизлежащим ε-аминогруппам лизина с образованием так называемого лизиноаланина— соединения, присутствие которого в кислотном гид-ролизате белка свидетельствует о глубоком повреждении его структуры.

Причиной денатурации может стать применение органических растворителей,способных нарушить существенную для стабильности белка систему гидрофобных контактов внутри глобулы. Надо также учитывать возможность денатурации белка на границе раздела фаз, В особенности при образовании пены. При выделении очень малых количеств белка, не редком в современной биохимии, следует считаться с потерями, вызываемыми его адсорбцией, часто необратимой, на поверхности стекла или полимерных материалов, особенно значительной на заключительных стадиях очистки.

Особую опасность при выделении белков представляют содержащиеся в исходном материале протеолитические ферменты, даже если они присутствуют в следовых количествах. Повреждение, которое приводит к образованию ложных множественных форм белка, а иногда и его глубокое расщепление становятся особенно вероятными, если схема выделения включает условия, приближающие белок к денатурации. Для предотвращения протеолиза необходимо уже на ранних стадиях очистки включать операции, направленные на отделение протеиназ, прибавлять к смеси ингибиторы различных классов протеиназ. Очень важно проводить очистку белка быстро, что снижает опасность протеолиза и вероятность денатурации.

Распространено мнение об особой нестабильности чистых белков.Действительно, содержащиеся в неочищенных препаратах посторонние белки в определенной мере защищают белок от денатурирующих воздействий и протеолиза. На промежуточных стадиях, когда полная

очистка еще не достигнута, опасность протеолиза увеличивается, с удалением же следов протеиназ на завершающих этапах очистки стабильность белка должна вновь возрасти. Впрочем, возрастает и опасность сорбционных потерь на поверхностях, которые могут восприниматься экспериментатором как присущая чистому белку нестабильность.

Характерные свойства белков, на которых основано их разделение

На каких физико-химических особенностях белков могут быть основаны способы их разделения? Во-первых, это размер молекулы, ее геометрия.На использовании этой особенности базируются методы гель-хроматографии и ультрафильтрации, отчасти электрофорез в гелях.

Во-вторых, характерное для данного белка распределение заряженных группна его поверхности. Соотношение катионных и анионных групп в белке меняется в зависимости от рН, изоэлектрические точки белков — pI (значения рН, при котором положительные и отрицательные заряды белка полностью компенсированы и суммарный заряд равен нулю) существенно различаются у разных белков. Известны белки, являющиеся в физиологических условиях катионными, анионными или молекулами без заметного преобладания того или иного заряда. На различии заряда белков при разных рН основано их разделение методами электрофореза, изоэлектрического фокусирования, изоэлектрической и ионообменной хроматографии. Существенно, однако, не только соотношение заряженных групп, определяющее значение pI. Белки со сходными изоэлектрическими точками могут различаться распределением заряженных функциональных групп по поверхности глобулы. Последние размещаются более или менее равномерно либо; наоборот, образуют локальные сгущения, гроздья одинаково заряженных групп, что сказывается при ионнообменной хроматографии белка.

В-третьих, белки различаются числом и характером гидрофобных участков поверхности,что используют при гидрофобной хроматографии

Заметим, что ни один из рассмотренных выше признаков не может сам по себе обеспечить выделение индивидуального белка из сложной смеси — они недостаточно характеристичны, не гарантируют избирательности очистки. Значительно более перспективно в этом отношении

использование для выделения функциональных свойств белка.Действительно, среди множества белков в исходном материале найдется немало таких, которые имеют сходную молекулярную массу или близкие изоэлектрические точки, однако число, например, фосфатаз или амилаз будет заведомо небольшим. Очевидно, что метод выделения, основанный на использовании способности этих ферментов взаимодействовать со своим специфическим субстратом, несравненно избирательнее, чем любой прием, базирующийся на разнице физико-химических свойств.

Схемы выделения белков, использующие только один какой-либо принцип, редки, обычно различные подходы к фракционированию сочетаются и дополняют друг друга.

Разделение белков по молекулярной массе. Гель-хроматография (гель-фильтрация)

В этом методе используют гранулированные гелипоперечно-сшитых гидрофильных материалов,например декстрана (сефадекс, сефароза и их аналоги), полиакриламида(биогели и их аналоги), поливинилового спирта (тойоперл). Гранулы образованы трехмерной сеткой полимера, которая непроницаема для крупных молекул, частично проницаема для молекул промежуточного размера и хорошо проницаема для небольших молекул, солей и воды. В зависимости от среднего размера ячейки полимерного геля и геометрии молекулы последней доступна большая или меньшая часть общего объема гранул геля.

При движении раствора, содержащего белки и другие молекулы, по колонке, которая заполнена набухшими гранулами геля, компоненты смеси, проникшие в гель, задерживаются в нем. Таким образом, они отстают от более крупных молекул, которые не могут войти внутрь гранул и находятся только в омывающем их растворе. Не будучи включенными в гель, крупные молекулы появляются в элюате, как только через колонку пройдет "свободный" объем раствора , равный объему раствора, заключенному между гранулами геля. Последний определяется плотностью упаковки и геометрией гранул. Для сферических частиц, в виде которых обычно и выпускаются материалы для гель-хроматографии, свободный объем составляет 30—35% общего объема колонки .

Если размеры молекул белка таковы, что они могут проникать в поры, составляющие некоторую часть объема гранул, то будет наблюдаться задержка элюции и белок появится в объеме V_e , связанном с коэффициентом доступности (долей объема гранул, доступной данному виду молекул) соотношением:

где V, — полный объем колонки, за вычетом той его части, которая приходится на сам гель образующий полимер.

Каждому белку в зависимости от размеров его молекулы соответствует свое значение, на чем и основало разделение при гель-хроматографии. Понятно, что если объем элюции близок к свободному объему , то стремится к нулю и разделения белков, молекулы которых практически не входят в поры геля, не произойдет. Точно так же молекулы небольших размеров, для которых проницаем весь объем геля (V_e близок к и стремится к единице), в геле с данными характеристиками не разделятся. Наилучшее разрешение получается, если находится в пределах 0,4 — 0,6. Разумеется, пределы разделения можно расширить, используя для высокомолекулярных белков крупнопористые, а для небольших — мелкопористые гели.

Строго говоря, при гель-хроматографии разделение белков определяется не молекулярной массой, а геометрическими размерами молекулы. Соответственно, молекулы вытянутой формы за счет "кувыркания" в растворе труднее проникают в гели, чем сферические молекулы такой же молекулярной массы. Этим объясняется ранняя элюция денатурированных белков, которые ведут себя как неупорядоченный рыхлый клубок, а не как компактная глобула.

Простая зависимость между объемом элюции и молекулярной массой белка (справедливая, конечно, только для компактных сферических молекул) и легкость эксперимента сделали гель-хроматографию излюбленным методом определения молекулярной массы белков. Для этой цели колонку, заполненную соответствующим гелем, калибруют набором белков с известными молекулярными массами, после чего определяют объем элюции изучаемого белка и вычисляют его молекулярную массу интерполяцией. Точность метода не очень велика, но вполне достаточна для большинства практически встречающихся задач.

При использовании данного метода необходимо учитывать ограничения, возникающие из-за того, что гель, образующий материал невполне инертен, как это предполагает теория метода, и может взаимодействовать с разделяемыми веществами, что искажает зависимость объема элюции от размера молекулы. Это особенно сказывается при разделении малых количеств белка, так как сорбционная емкость матрицы геля невелика и в крупномасштабных опытах ее взаимодействие с белком мало отражается на процессе.

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--