Отчет по практике: Разделение пигментов методом бумажной хроматографии

Хроматограмму помещают в камеру, заполненную 30 мл смеси, состоящей из бензола и петролейного эфира (2:1). Через 30-40 минут, когда фронт растворителя поднимется на 14 см и будет видно четкое разделение пигментов, хроматограмму вынимают и подсушивают. Самую верхнюю полосу образует каротин, ниже него лежит хлорофилл а, под ним распологаются ксантофиллы, а самый последний – хлорофилл в.

Окрашенные полосы, соответствующие пигментам вырезают, измельчают и переносят в отдельные бюксы на 25 мл. Каротин эллюируется хлороформом, ксантофиллы и хлорофиллы – смесью спирта с ацетоном (1:3).

Растворитель добавляют небольшими порциями, каждый раз настаивая 2-3 минуты.

Эллюция пигментов с бумажного носителя

Эллюцию проводят до полного обесцвечивания бумаги. Элюат фильтруется через стеклянный фильтр или центрифугируется для удаления взвешенных частиц бумаги. Экстракт аккуратно сливают в мерные пробирки и доводят до 5-10 мл в зависимости от интенсивности окрашивания. Полученные экстракты используют для фотоколориметрии с использованием калибровочной кривой, построенной для определенного прибора.

Для получения калибровочных кривых использовали два раствора – раствор Гетри (для зеленых пигментов) и двухромовокислый калий (для желтых пигментов).

Определение оптической плотности пигментов

Оптическую плотность элюата определяют на фотоэлектроколориметре, за синим светофильтром для желтых пигментов и красным для зеленых. Желательно работать в средней области шкалы, где относительная ошибка прибора минимальна.

Оптическая плотность элюата

Д	Хлорофилл а	Хлорофилл в	каротин
	0,015	0,01	0,025

Перед тем, как рассчитать содержание пигментов, была построена калибровочная кривая. Использовали раствор известной концентрации 1% CuSO₄ *5H₂ O – 25,5 мл; 2%К₂ Сr₂ O₇ – 50 мл; 7% - NН₄ ОН (100мл раствора).

Желтые пигменты

разведение	Д
1:0	0,745
1:1	0,35
1:2	0,274
1:3	0,235
1:4	0,19
1:5	0,165
1:6	0,133

Зеленые пигменты

разведение	Д
1:0	0,38
1:1	0,18
1:2	0,12
1:3	0,1
1:4	0,095
1:5	0,08
1:6	0,065

После измерения оптической плотности был построен калибровочный график.

Эквиваленты:

Хлорофилл а – 23,3 мг

Хлорофилл в – 31,5 мг

Каротин – 2,35мг

Виолоксантин – 2,7 мг

По калибровочному графику с помощью оптической плотности элюата нашли концентрации хлорофиллов и каротиноидов. (рис1)

Затем рассчитали содержание пигментов по формуле

Х= (С1*Vэл*Vэк)Vн*Р,

где С1- концентрация пигмента в элюате, определенная по калибровочному графику согласно оптической плотности;

Vэл – объем элюта, мл; Vэк – объем экстракта из навески, мл; Vн – объем раствора, нанесенного на бумагу, мл; Р – навеска в г.

Ха = (4,5мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=225мг/л

Хв = (1мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=50мг/л

Хкар = (1,2мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=60мг/л

Чтобы сравнить получившиеся данные по двум способам расчета пигментов, необходимо привести к одним единицам измерения.

Ха =225мг/л/1000 = 0,225 мг/г

Хв = 50мг/л/1000 = 0,05 мг/г